Cepas de VIH genotípicamente resistentes en Taiwán

De 2008 a 2009, se recolectarán muestras de sangre de pacientes consecutivos infectados con el VIH-1 que recibieron atención para el VIH en el Hospital de la Universidad Nacional de Taiwán. Esperamos recopilar 100 casos que no hayan recibido antirretrovirales y 100 casos que sean pacientes con tratamiento previo. Se utilizará un formulario estandarizado de recopilación de casos para registrar datos demográficos y características clínicas y resultados de laboratorio, como la carga de ARN del VIH en plasma (PVL) y los recuentos de células CD4. La PVL se cuantificará mediante la prueba Cobas Amplicor HIV-1 MonitorTM, versión 1.5, (Roche Diagnostics Corporation, Indianápolis, EE. UU.) según el protocolo del fabricante. El recuento de células CD4 se determinará utilizando FACSFlow (Becton Dickinson). Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del hospital.

Se realizará la prueba de resistencia a fármacos genotípica interna para determinar los perfiles de resistencia a fármacos para el gen pol del VIH-1, centrándose en la proteasa, la transcriptasa inversa y la integrasa. Las mutaciones de resistencia a los medicamentos se identificarán con el uso del programa HIVdb de la base de datos de resistencia a los medicamentos del VIH de la Universidad de Stanford (http://hivdb.stanford.edu), de acuerdo con la lista de mutaciones de resistencia a los medicamentos del Consenso de la Sociedad Internacional del SIDA-EE. UU. Directrices [24]. Las cepas con mezclas genéticas de secuencias de tipo salvaje y mutantes en los residuos de aminoácidos que codifican para la mayor resistencia a los medicamentos se considerarán resistentes a los medicamentos. Según la interpretación dada por el programa HIVdb, las secuencias se dividirán en secuencias resistentes a los medicamentos, interpretadas como que tienen niveles de resistencia altos, intermedios y bajos, y las secuencias sensibles, interpretadas como sensibles y potencialmente resistentes. La resistencia a múltiples fármacos (MDR) se definirá como la resistencia genotípica a más de una clase de fármacos antirretrovirales. Las secuencias de referencia de varios subtipos y recombinantes se recuperarán de la base de datos de Los Álamos (http://hiv-web.lanl.gov/seq-db.html). Las secuencias se alinearán con el Clustal W enumerado en el paquete analítico MEGA (análisis de genética evolutiva molecular) (versión 3.0) [25] con ajustes manuales menores. Los árboles filogenéticos se construirán mediante el método de unión de vecinos basado en la matriz de distancia de 2 parámetros de Kimura que figura en el software MEGA. Los valores de arranque superiores a 750 de 1000 repeticiones se consideran significativos.

El fenotipo de aquellos con una mutación de aminoácido específica o única en el gen de la integrasa se determinará mediante un ensayo fenotípico interno. Brevemente, el fragmento p7 a vif, de aproximadamente 3,6 kb, se amplificará a partir del ARN viral del plasma de los pacientes y se clonará en nuestro clon viral principal (Figura 1). Los clones resultantes se transfectarán en células 293 para producir virus infecciosos, cuyos títulos se determinarán mediante el ensayo p24 y posteriormente se usarán cantidades iguales de virus para infectar PBMC de donantes sanos. Los títulos de virus en los sobrenadantes de las células infectadas después de 3, 5 y 7 días después de la infección en presencia o ausencia de los compuestos analizados se determinarán mediante PCR en tiempo real o ensayo de p24. La concentración mínima de compuestos requerida para reducir el 50% de las copias virales sobrenadantes (EC50) se calculará mediante análisis de regresión de las curvas de dosis-respuesta generadas a partir de PCR en tiempo real o ensayo de p24.