Genotypiske resistente HIV-stammer i Taiwan

Fra 2008 til 2009 vil der blive indsamlet blodprøver fra på hinanden følgende HIV-1-inficerede patienter, som modtog HIV-pleje på National Taiwan University Hospital. Vi forventer at indsamle 100 tilfælde, der er antiretroviralt naive, og 100 tilfælde, der er behandlingserfarne patienter. En standardiseret sagsindsamlingsformular vil blive brugt til at registrere data om demografiske og kliniske karakteristika og laboratorieresultater, såsom plasma HIV RNA-belastning (PVL) og CD4-celletal. PVL vil blive kvantificeret af Cobas Amplicor HIV-1 MonitorTM Test, version 1.5, (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, USA) i henhold til producentens protokol. CD4-celletallet vil blive bestemt ved hjælp af FACSFlow (Becton Dickinson). Denne undersøgelse blev godkendt af Hospitalets Institutional Review Board.

Den interne genotypiske lægemiddelresistenstest vil blive udført for at bestemme lægemiddelresistensprofilerne for HIV-1 pol-genet med fokus på protease, revers transkriptase og integrase. Lægemiddelresistensmutationer vil blive identificeret ved brug af HIVdb-programmet fra Stanford Universitys HIV Drug Resistance Database (http://hivdb.stanford.edu), i overensstemmelse med lægemiddelresistensmutationslisten fra International AIDS Society-USA Consensus Retningslinjer [24]. Stammer med genetiske blandinger af vildtype- og mutantsekvenser ved aminosyrerester, der koder for større lægemiddelresistens, vil blive betragtet som værende lægemiddelresistente. Baseret på den fortolkning, som HIVdb-programmet giver, vil sekvenser blive opdelt i de lægemiddelresistente sekvenser, der fortolkes som havende høje, mellemliggende og lave niveauer af resistens, og de sensitive sekvenser, fortolket som de sensitive og potentielt resistente. Multilægemiddelresistens (MDR) vil blive defineret som havende genotypisk resistens over for mere end én klasse af antiretrovirale lægemidler. Referencesekvenser af forskellige undertyper og rekombinanter vil blive hentet fra Los Alamos-databasen (http://hiv-web.lanl.gov/seq-db.html). Sekvenser vil blive justeret med Clustal W opført i MEGA (molekylær evolutionær genetik analyse) analytiske pakke (version 3.0) [25] med mindre manuelle justeringer. De fylogenetiske træer vil blive konstrueret ved hjælp af nabosammenføjningsmetoden baseret på Kimura 2-parameter afstandsmatrixen opført i MEGA-softwaren. Bootstrap-værdier større end 750 ud af 1.000 replikater anses for at være signifikante.

Fænotypen af ​​dem med specifik eller unik aminosyremutation ved integrase-genet vil blive bestemt ved hjælp af internt fænotypisk assay. Kort fortalt vil p7 til vif-fragmentet, ca. 3,6 kb, blive amplificeret fra patienters virale plasma-RNA og klonet ind i vores virale klon i vores rygrad (figur 1). De resulterende kloner vil blive transficeret ind i 293-celler for at producere infektiøse vira, hvis titere vil blive bestemt ved p24-assay, og lige store mængder af vira vil efterfølgende blive brugt til at inficere PBMC fra raske donorer. Virustitere i supernatanterne fra inficerede celler efter 3, 5 og 7 dage efter infektion i nærvær eller fravær af testede forbindelser vil blive bestemt ved real-time PCR eller p24 assay. Den minimale koncentration af forbindelser, der kræves for at reducere 50 % af supernatant virale kopier (EC50), vil blive beregnet ved regressionsanalyse af dosis-respons-kurverne genereret fra real-time PCR eller p24 assay.