Cepas de HIV resistentes genotípicas em Taiwan

De 2008 a 2009, amostras de sangue serão coletadas de pacientes consecutivos infectados com HIV-1 que receberam tratamento para HIV no National Taiwan University Hospital. Esperamos coletar 100 casos virgens de antirretrovirais e 100 casos de pacientes com experiência em tratamento. Um formulário padronizado de coleta de casos será usado para registrar dados demográficos e características clínicas e resultados laboratoriais, como carga de RNA do HIV no plasma (PVL) e contagem de células CD4. A PVL será quantificada pelo teste Cobas Amplicor HIV-1 MonitorTM, versão 1.5, (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. A contagem de células CD4 será determinada usando FACSFlow (Becton Dickinson). Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do hospital.

O teste genotípico interno de resistência a drogas será realizado para determinar os perfis de resistência a drogas para o gene pol do HIV-1, com foco em protease, transcriptase reversa e integrase. As mutações de resistência a drogas serão identificadas com o uso do programa HIVdb do banco de dados de resistência a drogas de HIV da Universidade de Stanford (http://hivdb.stanford.edu), de acordo com a lista de mutações de resistência a drogas da International AIDS Society-USA Consensus Diretrizes [24]. Cepas com misturas genéticas de sequências de tipo selvagem e mutantes em resíduos de aminoácidos que codificam para grande resistência a drogas serão consideradas resistentes a drogas. Com base na interpretação dada pelo programa HIVdb, as sequências serão divididas em sequências resistentes a drogas, interpretadas como de alta, intermediária e baixa resistência, e sequências sensíveis, interpretadas como sensíveis e potencialmente resistentes. A resistência a múltiplas drogas (MDR) será definida como tendo resistência genotípica a mais de uma classe de drogas antirretrovirais. Sequências de referência de vários subtipos e recombinantes serão recuperadas do banco de dados de Los Alamos (http://hiv-web.lanl.gov/seq-db.html). As sequências serão alinhadas com o Clustal W listado no pacote analítico MEGA (análise molecular evolucionária) (versão 3.0) [25] com pequenos ajustes manuais. As árvores filogenéticas serão construídas pelo método de junção de vizinhos com base na matriz de distância Kimura de 2 parâmetros listada no software MEGA. Valores de bootstrap superiores a 750 de 1.000 réplicas são considerados significativos.

O fenótipo daqueles com mutação de aminoácido específica ou única no gene da integrase será determinado usando ensaio fenotípico in-house. Resumidamente, o fragmento p7 para vif, cerca de 3,6 kb, será amplificado a partir do RNA viral plasmático dos pacientes e clonado em nosso clone viral principal (Figura 1). Os clones resultantes serão transfectados em células 293 para produzir vírus infecciosos, cujos títulos serão determinados pelo ensaio de p24 e quantidades iguais de vírus serão subsequentemente usadas para infectar PBMC de doadores saudáveis. Os títulos de vírus nos sobrenadantes das células infectadas após 3, 5 e 7 dias pós-infecção na presença ou ausência dos compostos testados serão determinados por PCR em tempo real ou ensaio de p24. A concentração mínima de compostos necessária para reduzir 50% das cópias virais sobrenadantes (EC50) será calculada por análise de regressão das curvas dose-resposta geradas a partir de PCR em tempo real ou ensaio de p24.