Genotypisch resistente HIV-Stämme in Taiwan

Von 2008 bis 2009 werden Blutproben von aufeinanderfolgenden HIV-1-infizierten Patienten entnommen, die am National Taiwan University Hospital HIV-Behandlung erhalten haben. Wir gehen davon aus, dass wir 100 antiretroviral-naive Fälle und 100 behandlungserfahrene Patienten sammeln werden. Ein standardisiertes Fallerfassungsformular wird verwendet, um Daten zu demografischen und klinischen Merkmalen sowie Laborergebnissen wie der Plasma-HIV-RNA-Belastung (PVL) und der CD4-Zellzahl aufzuzeichnen. PVL wird mit dem Cobas Amplicor HIV-1 MonitorTM Test, Version 1.5, (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers quantifiziert. Die CD4-Zellzahl wird mit FACSFlow (Becton Dickinson) bestimmt. Diese Studie wurde vom Institutional Review Board des Krankenhauses genehmigt.

Der interne genotypische Arzneimittelresistenztest wird durchgeführt, um die Arzneimittelresistenzprofile für das HIV-1-Pol-Gen zu bestimmen, wobei der Schwerpunkt auf Protease, Reverse Transkriptase und Integrase liegt. Arzneimittelresistenzmutationen werden mithilfe des HIVdb-Programms der HIV Drug Resistance Database der Stanford University (http://hivdb.stanford.edu) gemäß der Liste der Arzneimittelresistenzmutationen des International AIDS Society-USA Consensus identifiziert Richtlinien [24]. Stämme mit genetischen Mischungen aus Wildtyp- und Mutantensequenzen an Aminosäureresten, die für eine starke Arzneimittelresistenz kodieren, werden als arzneimittelresistent angesehen. Basierend auf der Interpretation des HIVdb-Programms werden die Sequenzen in arzneimittelresistente Sequenzen, die als hoch, mittel und niedrig resistent interpretiert werden, und empfindliche Sequenzen, die als empfindlich und potenziell resistent interpretiert werden, unterteilt. Als Multiresistenz (MDR) wird eine genotypische Resistenz gegen mehr als eine Klasse antiretroviraler Medikamente definiert. Referenzsequenzen verschiedener Subtypen und Rekombinanten werden aus der Los Alamos-Datenbank (http://hiv-web.lanl.gov/seq-db.html) abgerufen. Die Sequenzen werden mit geringfügigen manuellen Anpassungen mit dem im MEGA-Analysepaket (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) (Version 3.0) [25] aufgeführten Clustal W abgeglichen. Die phylogenetischen Bäume werden mit der Neighbor-Joining-Methode basierend auf der Kimura-2-Parameter-Distanzmatrix erstellt, die in der MEGA-Software aufgeführt ist. Bootstrap-Werte über 750 von 1.000 Replikaten gelten als signifikant.

Der Phänotyp derjenigen mit spezifischer oder einzigartiger Aminosäuremutation im Integrase-Gen wird mithilfe eines hauseigenen phänotypischen Tests bestimmt. Kurz gesagt, das etwa 3,6 kb große p7-zu-vif-Fragment wird aus der Plasma-Virus-RNA des Patienten amplifiziert und in unseren Backbone-Virusklon geklont (Abbildung 1). Die resultierenden Klone werden in 293-Zellen transfiziert, um infektiöse Viren zu produzieren, deren Titer durch einen p24-Assay bestimmt werden und gleiche Mengen an Viren werden anschließend verwendet, um PBMC von gesunden Spendern zu infizieren. Die Virustiter in den Überständen infizierter Zellen 3, 5 und 7 Tage nach der Infektion werden in Gegenwart oder Abwesenheit der getesteten Verbindungen durch Echtzeit-PCR oder p24-Assay bestimmt. Die minimale Konzentration an Verbindungen, die erforderlich ist, um 50 % der überstehenden Viruskopien (EC50) zu reduzieren, wird durch Regressionsanalyse der Dosis-Wirkungs-Kurven berechnet, die durch Echtzeit-PCR oder p24-Assay erstellt wurden.