頭頸部扁平上皮癌におけるヒトパピローマウイルス（HPV） (HPV)

イスラエルにおける頭頸部がんに関連する高リスクのヒトパピローマウイルスの有病率を判定し、分類する。 私たちは、この地域の民族的独自性を研究するために、イスラエルにおける HPV 遺伝子型の分布を決定します。 多くの研究により、HPV 16 が HNSCC で最も蔓延しているタイプであることが示されています (NEJM)。 イスラエルのユダヤ人女性では、HPV 16、39、52、および 18 型が最もよく見られる遺伝子型でした (15)。 私たちの目的では、HNSCC 検体におけるさまざまな HPV 遺伝子型の有病率を決定します。 研究対象集団 このグループには、1998 年から 2010 年の間に口腔、中咽頭、下咽頭の SCC に対して補助放射線療法の有無にかかわらず、初回手術または生検で治療された患者が含まれます。 、喉頭および副鼻腔。

原発腫瘍の解剖学的部位と範囲が記録されます。 TNM 分類は、米国癌合同委員会 (AJCC) によって改訂された病期分類システムに基づいています。 患者は、ネゲブのソロカ医療センター（ベエルシェバ）、ソウラスキー医療センター（テルアビブ）、ラビン医療センター（ペタク・チクヴァ）、ハダッサ医療センター（エルサレム）、ランバン医療センター（ハイファ）を含む7つの国立がん紹介病院から募集される。 ）、シバ医療センター（ラマトガン）、フランス病院ナザレ（ナザレ）。 これらのセンターは、イスラエルのユダヤ人、ベドウィン、ドゥルーズ派、イスラエルのアラブ人を含むイスラエルのほぼ全人口をカバーしています。

データ入力 データは市販のスプレッドシート (Microsoft Excel 2000、Microsoft Corporation、シアトル、ワシントン州) に入力され、統計分析はコンピューター化されたソフトウェア パッケージ (SPSS) を使用して実行されます。 私たちは以前、同様のシステムを使用して、17のがんセンターを含む国際多施設研究で頭蓋底肉腫患者146人の結果を報告しました(17)。

腫瘍標本 標本は遡及的に収集され、原発腫瘍のパラフィン切片または各センターの病理部門のアーカイブから回収された生検で構成されます。 パラフィン除去と HPV 検査のためのパラフィンブロックのテルアビブへの輸送は、研究者によって個人的に行われます。 組織病理学的分析 原発腫瘍標本は、参加する各がんの病理学者によって最初に評価されます。 その後、すべての標本は頭頸部病理学者のカプラン・イラナ博士によって再分析および評価されます。 原発腫瘍の標本解剖および組織サンプリングは、頭頸部癌の組織病理学的評価に関する現在のガイドラインに従って行われます。

実験室での HPV 検出 組織切片は、前述のように (18)、脱パラフィン、熱誘発標的回復、プロテイナーゼ K (Roche Diagnostics、インディアナ州インディアナポリス) による消化を受けます。 次に、脱パラフィン、プロテイナーゼ K 消化、フェノール/クロロホルム抽出、およびエタノール沈殿によって、パラフィンから DNA が精製されます。 我々は、37 種類の HPV タイプの遺伝子型を決定するために、PCR ベースの HPV GenoArray 検査キットを使用した HPV 遺伝子型決定システムを使用します (Hybribio Limited、香港)。 標本をPreservCytR LBC培地（ThinPrep液体Papバイアル；Cytyc Corporation）に入れる。 Amplicor HPV テストキットには、13 の HR 遺伝子型 (タイプ 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、および 68) から HPV DNA を増幅するように設計された HPV 特異的プライマーのプールが含まれています。 ）。 メーカーの仕様書によると、Amplicor HPV 検査は、HPV 遺伝子型 31、52、58、および 59 を 240 コピー/ml で検出し、HPV 遺伝子型 16、18、33、35、39、45、51、56、および 68 を 100 コピーで検出します。 /mlで陽性率95%以上。 すべての遺伝子型は 480 コピー/ml で 100% の陽性率で検出されます。

HPV ジェノタイピング HPV ジェノタイピングは、市販の PCR ベースの HPV GenoArray 検査キット (Hybribio Limited、香港) を使用して実行されます。このキットでは、DNA 増幅と HybriBio 独自のフロースルー ハイブリダイゼーション技術の両方を利用して、低リスク 5 つを含む 21 の HPV 遺伝子型を同時に特定します。タイプ (タイプ 6、11、42、43、および 44)、14 HR タイプ (タイプ 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、および 68)、および 2 つの中間リスク タイプ (タイプ CP8304 および 53)。

この検査では、HPV 遺伝子型特異的オリゴヌクレオチドプローブが固定化されたナイロン膜を備えたマクロアレイ形式を使用します。 In Situ ハイブリダイゼーション システムは、結果の検証のために Amplicor HPV テスト (Roche Molecular Systems) を使用して実行されます。 このキットは、パラフィン包埋組織内のヒトパピローマウイルス (HPV) DNA の検出と識別のために設計されています。 HPV16 陽性腫瘍標本は陽性対照として使用されます。

p16 免疫組織化学

p16 の発現状態は腫瘍 HPV 状態と強く相関している (19) ため、我々は免疫組織化学によってこのタンパク質の存在を評価する予定です (20)。 5 μm 切片を脱パラフィンした後、10 mM クエン酸緩衝液を使用した熱誘導エピトープ回復を使用して抗原回復を実行します。 免疫染色は、製造業者の推奨に従って、Ventana 自動染色装置 (Ventana Medical Systems、アリゾナ州ツーソン) を使用して実行されます。 HPV陽性であることが知られている子宮頸部検体は陽性対照として使用され、正常組織はベースライン対照として使用されます。 １：５００希釈のｐ１６に対するマウスモノクローナル抗体（ＭＴＭ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ハイデルベルク、ドイツ）を利用する。 p16 抗体は、アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ技術 (Dako LSAB Kit、Dako) を使用して検出されます。 病理組織学的検査では、p16 発現のパターンは一般に腫瘍サンプルに応じて二分的であり、p16 染色が存在しない (陰性) か、核および細胞質に強く拡散した染色が存在する (陽性) かのいずれかです。 相対的なタンパク質発現は、陽性染色の強度と領域を分析した専用ソフトウェア（Metamorph、Molecular Devices、カリフォルニア州ユニオンシティ）を使用して推定されます。 免疫組織化学的解釈は、HPV の状態と腫瘍の起源となった患者の身元を知らされていない 2 人の研究者によって行われます。

中咽頭/喉頭 SCC 患者における HPV の状態と治療反応または生存との関連性の評価 米国およびヨーロッパにおける一連の症例の前向き分析により、HPV 陽性の中咽頭 SCC 患者の予後は、腫瘍を有する患者よりも良好であることが一貫して証明されているHPV陰性である(21,22)。 我々は、一次化学放射線療法または放射線療法（臓器温存療法）で治療された中咽頭および喉頭SCC患者の治療反応および生存転帰に対する腫瘍HPV状態の影響を評価する予定である。

データ収集 各センターは患者のカルテからデータを収集します。 データには、年齢、性別、民族、出生地および居住地域、宗教、教育（在学歴、在学年数、中退年齢）、最長職業、さまざまな分野でのタバコの使用が含まれます。形態、飲酒習慣、食習慣、婚姻状況、性歴（生涯の性的パートナーの数、売春婦への訪問、オーラルセックスの頻度）、さまざまな病気の病歴、癌の家族歴、口腔の健康状態。 「喫煙者」とは、少なくとも 1 年間毎日タバコを吸ったと報告する個人として定義され、喫煙者には喫煙期間、喫煙したタバコの量と種類 (紙巻タバコ、葉巻、パイプ、またはあらゆる形式の噛みタバコ) について質問されます。 。 「飲酒者」とは、少なくとも月に 1 回アルコール飲料を飲むと報告する個人として定義されます。 飲料の種類、量、習慣的な飲酒期間などを詳しく聞きます。 腫瘍リンパ節転移の分類および病期分類に関する情報は研究対象患者から得られます。 この分類は、米国癌合同委員会 (AJCC) の癌病期分類マニュアルに従って病期に変換されます。 各治療法の成果を反応（RECIST分類による完全奏効、部分奏効、および進行性疾患）の観点から評価します。

統計分析 5 年全生存率 (OS)、疾患特異的生存率 (DSS)、および局所領域制御率はカプランマイヤー法を使用して計算され、生存率の差はログランク検定によって評価されます (17)。 OSは、手術日から死亡日または最後の追跡調査日まで測定されます。 DSS の場合、SCC 以外の原因で死亡した患者は死亡時に検閲されます。 単変量解析によって示唆された予後可能性を持つ変数は、Cox 比例ハザード回帰モデルを使用した多変量解析に供されます。 すべての統計は両面的なものになります。 P < 0.05 の値は、統計的有意性を示すと見なされます。 ＨＰＶ／ｐ１６分類（３クラスモデル）の比較は、クラスカル・ウォリス分析とそれに続くボンフェローニ補正を用いたウィルコクソン順位和検定によって実行される。 ＨＰＶ／ｐ１６分類によるタンパク質発現の比較は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とダネットのＴ３検定による事後比較を使用して行われる。 HPV - 3 つのクラス モデルの分類ステータスと特定の臨床的および病理学的変数 (性別、TNM ステージ、T ステージ、N ステージ、組織学的グレード、管理、放射線療法、化学放射線療法、アルコール使用、喫煙および臨床反応) との比較は、次の方法で実行されます。フィッシャーの正確検定。 臨床反応は、治療完了後に完全反応対無反応/部分反応として記録されます。 すべての計算と分析は、テルアビブ スーラキー医療センターの資格のある統計学者 (エスター シャブタイ博士) によって、Windows 用社会科学統計パッケージ バージョン 11.5 (SPSS Inc、イリノイ州シカゴ) を使用して実行されます。

サンプル数とその正当性 イスラエルにおける HNSCC の有病率は、年間中咽頭がん 52 人、喉頭がん 250 人が新たに発症すると推定されています (中東がんコンソーシアム、www.mecc.cancer.gov)。 この研究に参加する医療センターは、イスラエル国の人口の 80% をカバーしています。 症例患者の参加率は 89% (76 ～ 99.0% の範囲) になると我々は推定しています (REF JNCI International)。 したがって、6 か月の研究期間で約 100 のサンプルが収集されると推定されます。