Lidský papilomavirus (HPV) u spinocelulárního karcinomu hlavy a krku (HPV)

Stanovit prevalenci a klasifikovat vysoce rizikové typy lidského papilomaviru spojené s rakovinou hlavy a krku v Izraeli. Stanovíme distribuci genotypu HPV v Izraeli, abychom mohli studovat etnickou jedinečnost regionu. Mnoho studií ukázalo, že HPV 16 je nejrozšířenějším typem u HNSCC (NEJM). U izraelských židovských žen byly nejčastěji nalezenými genotypy HPV typy 16, 39, 52 a 18 (15). V našem cíli určíme prevalenci různých HPV genotypů ve vzorcích HNSCC. Studijní populace Soubor bude zahrnovat pacienty léčené primární operací nebo biopsií, s adjuvantní radioterapií nebo bez ní v letech 1998 až 2010 pro SCC dutiny ústní, orofaryngu, hypofaryngu , hrtanu a vedlejších nosních dutin.

Bude dokumentováno anatomické místo a rozsah primárního nádoru. TNM klasifikace bude založena na stagingovém systému revidovaném American Joint Committee on Cancer (AJCC). Pacienti se budou rekrutovat ze sedmi národních onkologických nemocnic, včetně Soroka Medical Center v Negevu (Beer Sheva), Sourasky Medical Center (Tel Aviv), Rabin Medical Center (Petach Tikva), Hadassa Medical (Jeruzalém), Rambam Medical Center (Haifa ), lékařské centrum Sheba (Ramat-Gan) a francouzská nemocnice Nazareth (Nazareth). Tato centra pokrývají téměř celou izraelskou populaci, včetně izraelských Židů, beduínů, Drúzů a izraelské arabské populace.

Zadávání dat Data budou vložena do komerčně dostupného tabulkového procesoru (Microsoft Excel 2000, Microsoft Corporation, Seattle, WA) a provede se statistická analýza pomocí počítačového softwarového balíčku (SPSS). Již dříve jsme použili podobný systém k vykazování výsledků 146 pacientů se sarkomy lební báze v mezinárodní multicentrické studii zahrnující 17 onkologických center (17).

Vzorky nádorů Vzorky budou odebírány retrospektivně a budou obsahovat parafínové řezy primárních nádorů nebo biopsie získané z archivů patologického oddělení v každém centru. Převoz parafínových bloků do Tel Avivu za účelem deparafinizace a testování HPV bude probíhat osobně vyšetřovateli. Histopatologická analýza Vzorky primárních nádorů budou nejprve hodnoceny patology u každé zúčastněné rakoviny. Všechny vzorky budou následně znovu analyzovány a vyhodnoceny patologem hlavy a krku Dr. Kaplanem Ilanou. Pitva vzorku a odběr tkáně primárního nádoru bude v souladu se současnými doporučeními pro histopatologické hodnocení karcinomu hlavy a krku.

Detekce HPV v laboratoři Tkáňové řezy budou podrobeny deparafinizaci, tepelně indukovanému získávání cíle a štěpení proteinázou K (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), jak bylo popsáno dříve (18). DNA je poté purifikována z parafinu deparafinizací, štěpením proteinázou K, extrakcí fenolem/chloroformem a srážením ethanolem. Použijeme genotypizační systém HPV využívající testovací soupravu HPV GenoArray na bázi PCR pro genotypizaci 37 HPV taypes (Hybribio Limited, Hong Kong). Vzorky se umístí do média PreservCytR LBC (ThinPrep tekutá Pap lahvička; Cytyc Corporation). Testovací sada Amplicor HPV obsahuje soubor primerů specifických pro HPV navržených pro amplifikaci HPV DNA z 13 genotypů HR (typy 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 a 68 ). Podle specifikace výrobce test Amplicor HPV detekuje HPV genotypy 31, 52, 58 a 59 při 240 kopiích/ml a HPV genotypy 16, 18, 33, 35, 39, 45, 51, 56 a 68 při 100 kopiích. /ml s mírou pozitivity vyšší než 95 %. Všechny genotypy jsou detekovány se 100% mírou pozitivity při 480 kopiích/ml.

Genotypizace HPV Genotypizace HPV se provádí pomocí komerčně dostupné testovací soupravy HPV GenoArray založené na PCR (Hybribio Limited, Hong Kong), která využívá jak amplifikaci DNA, tak patentovanou hybridizační techniku ​​HybriBio k současné identifikaci 21 genotypů HPV, včetně 5 nízkorizikových. typy (typy 6, 11, 42, 43 a 44), 14 typy HR (typy 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 a 68), a 2 typy se středním rizikem (typy CP8304 a 53).

Test využívá formát macroarray s nylonovou membránou, na které byly imobilizovány HPV genotypově specifické oligonukleotidové sondy. In situ hybridizační systém bude proveden s Amplicor HPV testem (Roche Molecular Systems) pro validaci výsledků. Tato souprava je určena pro detekci a rozlišení DNA lidského papilomaviru (HPV) v tkáni zalité v parafínu. Jako pozitivní kontrola bude použit HPV16-pozitivní vzorek nádoru.

p16 Imunohistochemie

Stav exprese p16 silně koreluje se stavem nádorového HPV (19), a proto přítomnost tohoto proteinu vyhodnotíme imunohistochemicky (20). Po deparafinizaci řezů o tloušťce 5 μm se provede získání antigenu použitím teplem indukovaného získání epitopu s 10 mM citrátovým pufrem. Imunobarvení bude provedeno automatickým barvidlem Ventana (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) podle doporučení výrobce. Vzorek z děložního hrdla, o kterém je známo, že je pozitivní na HPV, bude použit jako pozitivní kontrola a normální tkáně jako základní kontroly. Bude použita myší monoklonální protilátka proti p16 (MTM Laboratories, Heidelberg, Německo) v ředění 1:500. Protilátka p16 je detekována pomocí techniky avidin-biotin-peroxidázy (Dako LSAB Kit, Dako). Při histopatologickém přehledu je vzorec exprese p16 obecně dichotomický podle vzorku nádoru, přičemž barvení p16 buď chybí (negativní), nebo je přítomno se silným a difúzním jaderným a cytoplazmatickým barvením (pozitivní). Relativní proteinová exprese bude odhadnuta pomocí specializovaného softwaru (Metamorph, Molecular Devices, Union City, CA), který analyzoval intenzitu a oblast pozitivního barvení. Imunohistochemickou interpretaci provedou dva vyšetřovatelé zaslepení vůči stavu HPV a identitě pacientky, od které nádor pochází.

Hodnocení souvislosti mezi stavem HPV a terapeutickou odpovědí nebo přežitím u pacientů s orofaryngeálním/laryngeálním SCC Prospektivní analýzy sérií případů ve Spojených státech a Evropě konzistentně prokázaly, že pacienti s orofaryngeálním SCC, kteří jsou HPV-pozitivní, mají lepší prognózu než pacienti s nádory jsou HPV negativní (21,22). Budeme hodnotit vliv stavu nádorového HPV na léčebnou odpověď a výsledky přežití u pacientů s orofaryngeálním a laryngeálním SCC, kteří byli léčeni primární chemoradiací nebo radiační terapií (režim zachování orgánů).

Sběr dat Každé centrum bude sbírat data z tabulek pacientů. Údaje budou zahrnovat: věk, pohlaví, etnickou skupinu, místo narození a bydliště, náboženství, vzdělání (vždy školní docházka, počet let školní docházky a věk při ukončení školy), nejdelší zaměstnání, užívání tabáku v různých formy, pití alkoholu, stravovací návyky, rodinný stav, sexuální historie (počet celoživotních sexuálních partnerů, návštěvy prostitutek a frekvence orálního sexu), historie různých onemocnění, rodinná anamnéza rakoviny a zdraví dutiny ústní. "Kuřák" je definován jako osoba, která uvádí, že kouří tabák denně po dobu alespoň 1 roku, a kuřáků bude dotázáno na délku kouření a množství a typ vykouřeného tabáku (cigarety, doutníky, dýmky nebo jakákoli forma žvýkání tabáku) . „Piják“ je definován jako fyzická osoba, která uvádí pití alkoholických nápojů alespoň jednou měsíčně. Budou získány podrobnosti o typech nápojů, množství a délce obvyklého pití. od pacientů ve studii budou získány informace o klasifikaci a stagingu nádorových uzlů a metastáz. Tato klasifikace bude převedena na stádium podle příručky American Joint Committee on Cancer (AJCC) Cancer Staging Manual. Zhodnotíme výsledek každé terapie z hlediska odpovědi (kompletní odpověď, částečná odpověď a progresivní onemocnění podle klasifikace RECIST)

Statistická analýza Pětileté celkové přežití (OS), míra přežití specifická pro onemocnění (DSS) a míra lokoregionální kontroly budou vypočteny pomocí Kaplan-Meierovy metody a rozdíl v míře přežití bude hodnocen log rank testem (17). OS se bude měřit od data operace do data úmrtí nebo poslední kontroly. U DSS budou pacienti, kteří zemřeli z jiných příčin než SCC, v době smrti cenzurováni. Proměnné, které budou mít prognostický potenciál navržený jednorozměrnou analýzou, budou podrobeny vícerozměrné analýze pomocí Coxova regresního modelu proporcionálních rizik. Všechny statistiky budou oboustranné. Hodnota P < 0,05 bude považována za statistickou významnost. Porovnání klasifikace HPV/p16 (model tří tříd) bude provedeno pomocí Kruskal-Wallisovy analýzy následované Wilcoxonovým rank sum testem s Bonferroniho korekcemi. Srovnání proteinové exprese podle klasifikace HPV/p16 bude provedeno pomocí jednocestné analýzy rozptylu (ANOVA) s post hoc srovnáním Dunnettovým T3 testem. Srovnání HPV - třítřídní model klasifikace se specifickými klinickými a patologickými proměnnými (pohlaví, TNM stadium, T stadium, N stadium, histologický stupeň, léčba, radioterapie, chemoradiace, užívání alkoholu, užívání tabáku a klinická odpověď) bude provedeno Fisherův přesný test. Klinická odpověď bude zaznamenána jako úplná odpověď versus žádná odpověď/částečná odpověď po dokončení léčby. Všechny výpočty a analýzy budou provedeny pomocí Statistického balíčku pro sociální vědy verze 11.5 pro Windows (SPSS Inc, Chicago, IL), kvalifikovaným statistikem v Tel Aviv Souraky Medical Center (Esther Shabtai PhD).

Velikost vzorku a její zdůvodnění Prevalence HNSCC v Izraeli se odhaduje na 52 nových případů rakoviny orofaryngu a 250 nových případů rakoviny hrtanu ročně (konsorcium pro rakovinu na Středním východě, www.mecc.cancer.gov). Zdravotnická centra, která se budou podílet na této studii, pokrývají 80 % populace Státu Izrael. odhadujeme, že míra účasti mezi pacienty s případem bude 89 % (rozsah od 76 do 99,0 %) (REF JNCI International). Proto se odhaduje, že studijní období 6 měsíců bude nabráno přibližně 100 vzorků.