Ihmisen papilloomavirus (HPV) pään ja kaulan okasolusyöpään (HPV)

Pään ja kaulan syöpään liittyvien korkeariskisten ihmisen papilloomavirustyyppien levinneisyyden määrittäminen ja luokittelu Israelissa. Selvitämme HPV-genotyyppijakauman Israelissa tutkiaksemme alueen etnistä ainutlaatuisuutta. Monet tutkimukset ovat osoittaneet HPV 16:n olevan HNSCC:n (NEJM) yleisin tyyppi. Israelin juutalaisnaisilla HPV-tyypit 16, 39, 52 ja 18 olivat yleisimmät löydetyt genotyypit (15). Tavoitteemme on määrittää erilaisten HPV-genotyyppien esiintyvyys HNSCC-näytteissä. Tutkimuspopulaatio Ryhmään kuuluvat potilaat, jotka on hoidettu primaarisella leikkauksella tai biopsialla, joko adjuvanttisädehoidolla tai ilman adjuvanttihoitoa vuosina 1998-2010 suuontelon, suunielun, hypofarynksin SCC:n vuoksi. , kurkunpään ja sivuonteloiden.

Primaarisen kasvaimen anatominen paikka ja laajuus dokumentoidaan. TNM-luokitus perustuu American Joint Committee on Cancerin (AJCC) tarkistamaan vaiheistusjärjestelmään. Potilaat rekrytoidaan seitsemästä kansallisesta syöpäsairaalasta, mukaan lukien Soroka Medical Center Negevissä (Beer Sheva), Sourasky Medical Center (Tel Aviv), Rabin Medical Center (Petach Tikva), Hadassa Medical (Jerusalem), Rambam Medical Center (Haifa) ), Sheban lääketieteellinen keskus (Ramat-Gan) ja ranskalainen sairaala Nazareth (Nasaret). Nämä keskukset kattavat lähes koko Israelin väestön, mukaan lukien Israelin juutalaiset, beduiinit, druusit ja Israelin arabiväestö.

Tietojen syöttö Tiedot syötetään kaupallisesti saatavilla olevaan laskentataulukkoon (Microsoft Excel 2000, Microsoft Corporation, Seattle, WA) ja tilastollinen analyysi suoritetaan tietokoneistetun ohjelmistopaketin (SPSS) avulla. Olemme aiemmin käyttäneet samanlaista järjestelmää raportoidaksemme tulokset 146 potilaan, joilla oli kallonpohjan sarkooma, kansainvälisessä monikeskustutkimuksessa, johon osallistui 17 syöpäkeskusta (17).

Kasvainnäytteet Näytteet kerätään takautuvasti, ja ne koostuvat primaaristen kasvainten parafiinileikkeistä tai biopsioista, jotka on haettu kunkin keskuksen patologian osaston arkistoista. Tutkijat kuljettavat parafiinilohkot Tel Aviviin parafiinien poistamista ja HPV-testausta varten henkilökohtaisesti. Histopatologinen analyysi Patologit arvioivat ensin primaariset kasvainnäytteet jokaisen osallistuvan syövän kohdalla. Pään ja kaulan patologi, tohtori Kaplan Ilana, analysoi ja arvioi kaikki näytteet uudelleen. Primaarisen kasvaimen näytteiden dissektio ja kudosnäytteiden otto tapahtuu pään ja kaulan syövän karsinooman histopatologisen arvioinnin nykyisten ohjeiden mukaisesti.

HPV-detektio laboratoriossa Kudosleikkeille tehdään parafiinipoisto, lämmön aiheuttama kohteen haku ja digestio proteinaasi K:lla (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), kuten aiemmin on kuvattu (18). Sen jälkeen DNA puhdistetaan parafiinista deparafiinilla, proteinaasi K -digestiolla, fenoli/kloroformiuutolla ja etanolisaostuksella. Käytämme HPV-genotyypitysjärjestelmää käyttäen PCR-pohjaista HPV GenoArray -testisarjaa 37 HPV-taypesin (Hybribio Limited, Hong Kong) genotyypitykseen. Näytteet laitetaan PreservCytR LBC -väliaineeseen (ThinPrep liquid Pap -pullo; Cytyc Corporation). Amplicor HPV -testipakkaus sisältää joukon HPV-spesifisiä alukkeita, jotka on suunniteltu monistamaan HPV-DNA:ta 13 HR-genotyypistä (tyypit 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 ja 68). ). Valmistajan ohjeiden mukaan Amplicor HPV -testi havaitsee HPV-genotyypit 31, 52, 58 ja 59 240 kopiolla/ml ja HPV-genotyypit 16, 18, 33, 35, 39, 45, 51, 56 ja 68 100 kopiolla. /ml positiivisuusasteella yli 95 %. Kaikki genotyypit havaitaan 100 %:n positiivisuusasteella 480 kopiolla/ml.

HPV-genotyypitys HPV-genotyypitys suoritetaan käyttämällä kaupallisesti saatavilla olevaa PCR-pohjaista HPV GenoArray -testisarjaa (Hybribio Limited, Hong Kong), joka hyödyntää sekä DNA-monistusta että HybriBion patentoitua läpivirtaushybridisaatiotekniikkaa tunnistamaan samanaikaisesti 21 HPV-genotyyppiä, mukaan lukien 5 matalariskistä. tyypit (tyypit 6, 11, 42, 43 ja 44), 14 HR-tyyppiä (tyypit 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 ja 68), ja 2 keskitason riskityyppiä (tyypit CP8304 ja 53).

Testissä käytetään macroarray-formaattia, jossa on nailonkalvo, jolle on immobilisoitu HPV-genotyyppispesifiset oligonukleotidikoettimet. In situ -hybridisaatiojärjestelmä suoritetaan Amplicor HPV -testillä (Roche Molecular Systems) tulosten validoimiseksi. Tämä pakkaus on suunniteltu ihmisen papilloomaviruksen (HPV) DNA:n havaitsemiseen ja erottamiseen parafiiniin upotetussa kudoksessa. HPV16-positiivista kasvainnäytettä käytetään positiivisena kontrollina.

p16 Immunohistokemia

p16:n ekspressiotila korreloi voimakkaasti kasvaimen HPV-statuksen kanssa (19), ja siksi arvioimme tämän proteiinin läsnäolon immunohistokemian avulla (20). Kun 5 μm:n leikkeet on deparafiini poistettu, antigeenin haku suoritetaan käyttämällä lämmön aiheuttamaa epitooppihakua 10 mM sitraattipuskurilla. Immunovärjäys suoritetaan automaattisella Ventana-värjäyslaitteella (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) valmistajan suositusten mukaisesti. Kohdunkaulan näytettä, jonka tiedetään olevan HPV-positiivinen, käytetään positiivisena kontrollina ja normaaleja kudoksia peruskontrollina. Käytetään hiiren monoklonaalista vasta-ainetta p16:ta vastaan ​​(MTM Laboratories, Heidelberg, Saksa) laimennoksena 1:500. p16-vasta-aine havaitaan käyttämällä avidiini-biotiini-peroksidaasitekniikkaa (Dako LSAB Kit, Dako). Histopatologisessa tarkastelussa p16:n ilmentymismalli on yleensä kaksijakoinen kasvainnäytteen mukaan, ja p16:n värjäytyminen joko puuttuu (negatiivinen) tai esiintyy vahvalla ja diffuusilla tuma- ja sytoplasmavärjäyksellä (positiivinen). Proteiinin suhteellinen ilmentyminen arvioidaan käyttämällä erityistä ohjelmistoa (Metamorph, Molecular Devices, Union City, CA), joka analysoi positiivisen värjäytymisen intensiteetin ja alueen. Immunohistokemiallisen tulkinnan suorittaa kaksi tutkijaa, jotka ovat sokeutuneet HPV-tilan ja sen potilaan henkilöllisyyden suhteen, jolta kasvain on peräisin.

HPV-tilan ja terapeuttisen vasteen tai eloonjäämisen välisen yhteyden arviointi potilailla, joilla on suunnielun/kurkunpään SCC ovat HPV-negatiivisia (21,22). Arvioimme kasvaimen HPV-statuksen vaikutusta hoitovasteeseen ja eloonjäämistuloksiin potilailla, joilla on suunnielun ja kurkunpään SCC ja joita hoidettiin ensisijaisella kemosäteily- tai sädehoidolla (elinten säilytysohjelma).

Tiedonkeruu Jokainen keskus kerää tietoja potilaskartoista. Tiedot sisältävät: ikä, sukupuoli, etninen ryhmä, syntymä- ja asuinalue, uskonto, koulutus (ainakaan koulunkäynti, koulunkäyntivuosien määrä ja ikä koulun päättyessä), pisin ammatti, tupakan käyttö eri muodoissaan muodot, alkoholin juomistottumukset, ruokailutottumukset, siviilisääty, sukupuolihistoria (elämänaikaisten seksikumppaneiden lukumäärä, prostituoitujen käynnit ja suuseksin tiheys), eri sairauksien historia, suvussa esiintynyt syöpää ja suuontelon terveys. "Tupakoitsija" määritellään henkilöksi, joka ilmoittaa polttaneensa tupakkaa päivittäin vähintään vuoden ajan, ja tupakoijilta kysytään tupakoinnin kestoa sekä poltetun tupakan määrää ja tyyppiä (savukkeet, sikarit, piiput tai mikä tahansa tupakan pureskelu) . "Juomari" määritellään henkilöksi, joka ilmoittaa juoneensa alkoholijuomia vähintään kerran kuukaudessa. Tiedot saadaan juomatyypeistä, määristä ja tavanomaisen juomisen kestosta. Tutkimuspotilailta saadaan tietoa kasvain-solmuke-metastaasien luokittelusta ja vaiheista. Tämä luokitus muunnetaan vaiheeksi American Joint Committee on Cancer (AJCC) Cancer Staging Manualin mukaan. Arvioimme kunkin hoidon tuloksen vasteen suhteen (täydellinen vaste, osittainen vaste ja etenevä sairaus RECIST-luokituksen mukaan)

Tilastollinen analyysi Viiden vuoden kokonaiseloonjääminen (OS), sairauskohtaiset eloonjäämisluvut (DSS) ja paikalliset kontrolliluvut lasketaan Kaplan-Meier-menetelmällä ja ero eloonjäämisluvuissa arvioidaan log rank -testillä (17). OS mitataan leikkauspäivästä kuolemaan tai viimeiseen seurantaan. DSS:n osalta potilaat, jotka kuolivat muista syistä kuin SCC:stä, sensuroidaan kuolinhetkellä. Muuttujat, joilla on yksimuuttujaanalyysin ehdottama ennustepotentiaali, alistetaan monimuuttujaanalyysille Coxin suhteellisten vaarojen regressiomallilla. Kaikki tilastot ovat kaksipuolisia. Arvon P < 0,05 katsotaan osoittavan tilastollista merkitsevyyttä. HPV/p16-luokituksen vertailu (kolmiluokkainen malli) suoritetaan Kruskal-Wallis-analyysillä, jota seuraa Wilcoxonin rank-summatesti Bonferroni-korjauksilla. Proteiinin ilmentymisen vertailu HPV/p16-luokituksen avulla tehdään käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA) ja post hoc -vertailuja Dunnettin T3-testillä. HPV:n vertailun - kolmen luokan mallin luokittelutilan erityisillä kliinisillä ja patologisilla muuttujilla (sukupuoli, TNM-vaihe, T-vaihe, N-aste, histologinen aste, hoito, sädehoito, kemosäteilyhoito, alkoholin käyttö, tupakan käyttö ja kliininen vaste) suorittaa Fisherin tarkka testi. Kliininen vaste kirjataan täydellisenä vasteena verrattuna ei vasteeseen/osittaiseen vasteeseen hoidon päätyttyä. Tel Aviv Souraky Medical Centerin pätevä tilastotieteilijä (Esther Shabtai PhD) suorittaa kaikki laskelmat ja analyysit Statistical Package for the Social Sciences -versiolla 11.5 for Windows (SPSS Inc, Chicago, IL).

Otoskoko ja sen perustelut HNSCC:n esiintyvyyden Israelissa arvioidaan olevan 52 suunielun ja 250 kurkunpääsyöpää vuodessa (Lähi-idän syöpäkonsortio, www.mecc.cancer.gov). Tähän tutkimukseen osallistuvat lääketieteelliset keskukset kattavat 80 % Israelin valtion väestöstä. arvioimme, että tapauspotilaiden osallistumisaste on 89 % (vaihteluväli 76 - 99,0 %) (REF JNCI International). Tästä syystä on arvioitu, että 6 kuukauden tutkimusjakso rekrytoidaan noin 100 näytettä.