Virus du papillome humain (VPH) dans le carcinome épidermoïde de la tête et du cou (HPV)

Déterminer la prévalence et classer les types de papillomavirus humains à haut risque associés au cancer de la tête et du cou en Israël. Nous déterminerons la distribution des génotypes du VPH en Israël afin d'étudier l'unicité ethnique de la région. De nombreuses études ont montré que le VPH 16 est le type le plus répandu dans le HNSCC (NEJM). Chez les femmes juives israéliennes, les types de VPH 16, 39, 52 et 18 étaient les génotypes les plus répandus trouvés (15). Dans notre objectif, nous allons déterminer la prévalence de différents génotypes de HPV dans les échantillons HNSCC. , du larynx et des sinus paranasaux.

Le site anatomique et l'étendue de la tumeur primaire seront documentés. La classification TNM sera basée sur le système de stadification révisé par l'American Joint Committee on Cancer (AJCC). Les patients seront recrutés dans sept hôpitaux nationaux de référence contre le cancer, dont le centre médical Soroka dans le Néguev (Beer Sheva), le centre médical Sourasky (Tel Aviv), le centre médical Rabin (Petach Tikva), Hadassa Medical (Jérusalem), le centre médical Rambam (Haïfa ), le centre médical Sheba (Ramat-Gan) et l'hôpital français Nazareth (Nazareth). Ces centres couvrent la quasi-totalité de la population d'Israël, y compris les Juifs israéliens, les Bédouins, les Druzes et la population arabe israélienne.

Saisie des données Les données seront saisies dans un tableur disponible dans le commerce (Microsoft Excel 2000, Microsoft Corporation, Seattle, WA) et l'analyse statistique sera effectuée à l'aide d'un progiciel informatisé (SPSS). Nous avons déjà utilisé un système similaire pour rapporter les résultats de 146 patients atteints de sarcomes de la base du crâne dans une étude multicentrique internationale incluant 17 centres de cancérologie (17).

Spécimens tumoraux Les spécimens seront collectés rétrospectivement et comprendront des coupes en paraffine de tumeurs primaires ou de biopsies extraites des archives du département de pathologie de chaque centre. Le transport des blocs de paraffine à Tel-Aviv pour la déparaphinisation et le test HPV sera effectué personnellement par les enquêteurs. Analyse histopathologique Les échantillons de tumeur primaire seront d'abord évalués par des pathologistes à chaque cancer participant. Tous les spécimens seront ensuite réanalysés et évalués par le pathologiste de la tête et du cou, le Dr Kaplan Ilana. La dissection des échantillons et l'échantillonnage des tissus de la tumeur primaire seront conformes aux directives actuelles pour l'évaluation histopathologique du cancer de la tête et du cou.

Détection du VPH au laboratoire Les coupes de tissus seront soumises à un déparaffinage, à une récupération de cible induite par la chaleur et à une digestion avec la protéinase K (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), comme décrit précédemment (18). L'ADN est ensuite purifié de la paraffine par déparaffinage, digestion à la protéinase K, extraction au phénol/chloroforme et précipitation à l'éthanol. Nous utiliserons le système de génotypage HPV en utilisant un kit de test HPV GenoArray basé sur la PCR pour le génotypage de 37 types de HPV (Hybribio Limited, Hong Kong). Les échantillons sont placés dans le milieu PreservCytR LBC (flacon ThinPrep liquid Pap ; Cytyc Corporation). Le kit de test Amplicor HPV contient un pool d'amorces spécifiques au HPV conçues pour amplifier l'ADN du HPV à partir de 13 génotypes HR (types 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 et 68 ). Selon les spécifications du fabricant, le test Amplicor HPV détecte les génotypes HPV 31, 52, 58 et 59 à 240 copies/ml et les génotypes HPV 16, 18, 33, 35, 39, 45, 51, 56 et 68 à 100 copies. /ml avec un taux de positivité supérieur à 95%. Tous les génotypes sont détectés avec un taux de positivité de 100% à 480 copies/ml.

Génotypage du VPH Le génotypage du VPH est effectué à l'aide d'un kit de test HPV GenoArray basé sur la PCR disponible dans le commerce (Hybribio Limited, Hong Kong), qui utilise à la fois l'amplification de l'ADN et la technique d'hybridation en continu exclusive d'HybriBio pour identifier simultanément 21 génotypes du VPH, dont 5 à faible risque. types (types 6, 11, 42, 43 et 44), 14 types HR (types 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 et 68), et 2 types à risque intermédiaire (types CP8304 et 53).

Le test utilise un format de macroréseau avec une membrane en nylon sur laquelle des sondes d'oligonucléotides spécifiques au génotype du VPH ont été immobilisées. Le système d'hybridation in situ sera réalisé avec le test Amplicor HPV (Roche Molecular Systems) pour la validation des résultats. Ce kit est conçu pour la détection et la discrimination de l'ADN du virus du papillome humain (VPH) dans les tissus inclus en paraffine. Un échantillon de tumeur HPV16-positif sera utilisé comme contrôle positif.

p16 Immunohistochimie

Le statut d'expression de p16 est fortement corrélé au statut tumoral HPV (19) et nous évaluerons donc la présence de cette protéine par immunohistochimie (20). Une fois que les coupes de 5 μm sont déparaffinées, la récupération d'antigène est effectuée en utilisant une récupération d'épitope induite par la chaleur avec un tampon citrate 10 mM. L'immunomarquage sera effectué avec un appareil de coloration automatisé Ventana (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) conformément aux recommandations du fabricant. Les échantillons cervicaux connus pour être positifs pour le VPH seront utilisés comme contrôle positif et les tissus normaux comme contrôles de référence. Un anticorps monoclonal de souris contre p16 (MTM Laboratories, Heidelberg, Allemagne) à une dilution de 1:500 sera utilisé. L'anticorps p16 est détecté par la technique avidine-biotine-peroxydase (Dako LSAB Kit, Dako). Lors de l'examen histopathologique, le schéma d'expression de p16 est généralement dichotomique selon l'échantillon de tumeur, avec une coloration de p16 absente (négative) ou présente avec une coloration nucléaire et cytoplasmique forte et diffuse (positive). L'expression relative des protéines sera estimée à l'aide d'un logiciel dédié (Metamorph, Molecular Devices, Union City, CA), qui a analysé l'intensité et la zone de coloration positive. L'interprétation immunohistochimique sera effectuée par deux enquêteurs ignorant le statut HPV et l'identité du patient dont la tumeur est issue.

Évaluation de l'association entre le statut HPV et la réponse thérapeutique ou la survie chez les patients atteints de SCC oropharyngé/laryngé sont HPV négatifs (21,22). Nous évaluerons l'effet du statut HPV de la tumeur sur la réponse au traitement et les résultats de survie chez les patients atteints de CSC oropharyngé et laryngé qui ont été traités par chimioradiothérapie primaire ou radiothérapie (régime de préservation des organes).

Collecte de données Chaque centre recueillera des données à partir des dossiers des patients. Les données comprendront : l'âge, le sexe, le groupe ethnique, le lieu de naissance et de résidence, la religion, l'éducation (la fréquentation scolaire, le nombre d'années de fréquentation scolaire et l'âge à la fin de l'école), la profession la plus ancienne, l'usage du tabac dans ses différentes formes, habitudes de consommation d'alcool, habitudes alimentaires, état matrimonial, antécédents sexuels (nombre de partenaires sexuels au cours de la vie, visites de prostituées et fréquence des relations sexuelles orales), antécédents de diverses maladies, antécédents familiaux de cancer et santé de la cavité buccale. Un "fumeur" est défini comme une personne qui déclare avoir fumé du tabac quotidiennement pendant au moins 1 an, et les fumeurs seront interrogés sur la durée du tabagisme et la quantité et le type de tabac fumé (cigarettes, cigares, pipes ou toute forme de tabac à chiquer) . Un « buveur » est défini comme une personne qui déclare consommer des boissons alcoolisées au moins une fois par mois. Des détails seront obtenus sur les types de boissons, les quantités et la durée de la consommation habituelle. des informations sur la classification et la stadification des métastases ganglionnaires tumorales seront obtenues auprès des patients de l'étude. Cette classification sera convertie en stade selon l'American Joint Committee on Cancer (AJCC) Cancer Staging Manual. Nous évaluerons le résultat de chaque thérapie en termes de réponse (réponse complète, réponse partielle et progression de la maladie selon la classification RECIST)

Analyse statistique Les taux de survie globale (OS) à cinq ans, de survie spécifique à la maladie (DSS) et de contrôle locorégional seront calculés à l'aide de la méthode de Kaplan-Meier et la différence de taux de survie sera évaluée par un test de log-rank (17). La SG sera mesurée à partir de la date de la chirurgie jusqu'à la date du décès ou du dernier suivi. Pour DSS, les patients décédés de causes autres que SCC seront censurés au moment du décès. Les variables qui auront un potentiel pronostique suggéré par l'analyse univariée seront soumises à une analyse multivariée avec le modèle de régression à risques proportionnels de Cox. Toutes les statistiques seront bilatérales. Une valeur de P < 0,05 sera considérée comme indiquant une signification statistique. La comparaison de la classification HPV/p16 (modèle à trois classes) sera effectuée par une analyse de Kruskal-Wallis suivie d'un test de somme des rangs de Wilcoxon avec corrections de Bonferroni. La comparaison de l'expression des protéines par classification HPV/p16 sera effectuée à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) avec des comparaisons post hoc par le test T3 de Dunnett. La comparaison du VPH - statut de classification du modèle à trois classes avec des variables cliniques et pathologiques spécifiques (sexe, stade TNM, stade T, stade N, grade histologique, prise en charge, radiothérapie, chimioradiothérapie, consommation d'alcool, tabagisme et réponse clinique), sera effectuée par Test exact de Fisher. La réponse clinique sera enregistrée en tant que réponse complète par rapport à aucune réponse/réponse partielle après la fin du traitement. Tous les calculs et analyses seront effectués avec le package statistique pour les sciences sociales version 11.5 pour Windows (SPSS Inc, Chicago, IL), par un statisticien qualifié du Tel Aviv Souraky Medical Center (Esther Shabtai PhD).

Taille de l'échantillon et sa justification La prévalence du HNSCC en Israël est estimée à 52 nouveaux cas de cancer oropharyngé et 250 nouveaux cas de cancer du larynx par an (Middle East cancer consorcium, www.mecc.cancer.gov). Les centres médicaux qui participeront à cette étude couvrent 80% de la population de l'État d'Israël. nous estimons que le taux de participation parmi les patients cas sera de 89 % (intervalle de 76 à 99,0 %) (REF JNCI International). Par conséquent, il est estimé qu'une période d'étude de 6 mois environ 100 échantillons seront recrutés.