Papillomavirus umano (HPV) nel carcinoma a cellule squamose della testa e del collo (HPV)

Determinare la prevalenza e classificare i tipi di papillomavirus umano ad alto rischio associati al cancro della testa e del collo in Israele. Determinare la distribuzione del genotipo HPV in Israele al fine di studiare l'unicità etnica della regione. Molti studi hanno dimostrato che l'HPV 16 è il tipo più diffuso nell'HNSCC (NEJM). Nelle donne ebree israeliane i tipi di HPV 16, 39, 52 e 18 erano i genotipi più diffusi trovati (15). Nel nostro obiettivo, determineremo la prevalenza di vari genotipi di HPV nei campioni di HNSCC. Popolazione in studio Il gruppo includerà pazienti trattati con chirurgia primaria o biopsia, con o senza radioterapia adiuvante tra il 1998 e il 2010 per SCC del cavo orale, orofaringe, ipofaringe , laringe e seni paranasali.

Il sito anatomico e l'estensione del tumore primitivo saranno documentati. La classificazione TNM si baserà sul sistema di stadiazione rivisto dall'American Joint Committee on Cancer (AJCC). I pazienti saranno reclutati da sette ospedali nazionali di riferimento per il cancro, tra cui il Soroka Medical Center nel Negev (Beer Sheva), il Sourasky Medical Center (Tel Aviv), il Rabin Medical Center (Petach Tikva), l'Hadassa Medical (Gerusalemme), il Rambam Medical Center (Haifa ), il centro medico Sheba (Ramat-Gan) e il French Hospital Nazareth (Nazareth). Questi centri coprono quasi l'intera popolazione in Israele, inclusi ebrei israeliani, beduini, drusi e popolazione araba israeliana.

Inserimento dati I dati verranno inseriti in un foglio di calcolo disponibile in commercio (Microsoft Excel 2000, Microsoft Corporation, Seattle, WA) e l'analisi statistica verrà eseguita utilizzando un pacchetto software computerizzato (SPSS). Abbiamo precedentemente utilizzato un sistema simile per riportare i risultati di 146 pazienti con sarcomi della base cranica in uno studio multicentrico internazionale che includeva 17 centri oncologici (17).

Campioni di tumore I campioni saranno raccolti in modo retrospettivo e comprenderanno sezioni di paraffina di tumori primari o biopsie recuperate dagli archivi del dipartimento di patologia di ciascun centro. Il trasporto dei blocchi di paraffina a Tel Aviv per la deparaffinazione e il test HPV avverrà personalmente dagli inquirenti. Analisi istopatologica I campioni di tumore primario saranno prima valutati dai patologi presso ciascun tumore partecipante. Tutti i campioni saranno quindi rianalizzati e valutati dal patologo della testa e del collo, Dr. Kaplan Ilana. La dissezione del campione e il campionamento del tessuto del tumore primario saranno conformi alle attuali linee guida per la valutazione istopatologica del carcinoma della testa e del collo.

Rilevamento dell'HPV in laboratorio Le sezioni di tessuto saranno sottoposte a deparaffinazione, recupero del target indotto dal calore e digestione con proteinasi K (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), come descritto in precedenza (18). Il DNA viene quindi purificato dalla paraffina mediante deparaffinazione, digestione con proteinasi K, estrazione con fenolo/cloroformio e precipitazione con etanolo. Utilizzeremo il sistema di genotipizzazione dell'HPV utilizzando un kit di test HPV GenoArray basato su PCR per la genotipizzazione di 37 tipi di HPV (Hybribio Limited, Hong Kong). I campioni vengono inseriti nel terreno PreservCytR LBC (fiala Pap liquida ThinPrep; Cytyc Corporation). Il kit per il test Amplicor HPV contiene un pool di primer specifici per HPV progettati per amplificare il DNA dell'HPV da 13 genotipi HR (tipi 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68 ). Secondo le specifiche del produttore, il test Amplicor HPV rileva i genotipi HPV 31, 52, 58 e 59 a 240 copie/ml e i genotipi HPV 16, 18, 33, 35, 39, 45, 51, 56 e 68 a 100 copie /ml con un tasso di positività superiore al 95%. Tutti i genotipi vengono rilevati con un tasso di positività del 100% a 480 copie/ml.

Genotipizzazione dell'HPV La genotipizzazione dell'HPV viene eseguita utilizzando un kit di test HPV GenoArray basato su PCR disponibile in commercio (Hybribio Limited, Hong Kong), che utilizza sia l'amplificazione del DNA che la tecnica di ibridazione a flusso brevettata di HybriBio per identificare simultaneamente 21 genotipi di HPV, inclusi 5 a basso rischio tipi (tipi 6, 11, 42, 43 e 44), 14 tipi HR (tipi 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68), e 2 tipi a rischio intermedio (tipi CP8304 e 53).

Il test utilizza un formato macroarray con una membrana di nylon su cui sono state immobilizzate sonde oligonucleotidiche specifiche del genotipo HPV. Il sistema di ibridazione in situ sarà eseguito con il test Amplicor HPV (Roche Molecular Systems) per la validazione dei risultati. Questo kit è progettato per il rilevamento e la discriminazione del DNA del virus del papilloma umano (HPV) nel tessuto incluso in paraffina. Un campione tumorale positivo per HPV16 verrà utilizzato come controllo positivo.

p16 Immunoistochimica

Lo stato di espressione di p16 è fortemente correlato con lo stato dell'HPV tumorale (19) e pertanto valuteremo la presenza di questa proteina mediante immunoistochimica (20). Dopo che le sezioni da 5 μm sono state deparaffinate, il recupero dell'antigene viene eseguito utilizzando il recupero dell'epitopo indotto dal calore con tampone citrato 10 mM. L'immunocolorazione sarà eseguita con un coloratore automatico Ventana (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) secondo le raccomandazioni del produttore. Il campione cervicale noto per essere positivo per l'HPV verrà utilizzato come controllo positivo e i tessuti normali come controlli di base. Verrà utilizzato un anticorpo monoclonale di topo contro p16 (MTM Laboratories, Heidelberg, Germania) a diluizione 1:500. L'anticorpo p16 viene rilevato utilizzando la tecnica dell'avidina-biotina-perossidasi (Dako LSAB Kit, Dako). Alla revisione istopatologica, il modello di espressione di p16 è generalmente dicotomico in base al campione tumorale, con colorazione p16 assente (negativa) o presente con colorazione nucleare e citoplasmatica forte e diffusa (positiva). L'espressione proteica relativa sarà stimata utilizzando un software dedicato (Metamorph, Molecular Devices, Union City, CA), che ha analizzato l'intensità e l'area della colorazione positiva. L'interpretazione immunoistochimica sarà eseguita da due ricercatori in cieco rispetto allo stato dell'HPV e all'identità del paziente da cui ha avuto origine il tumore.

Valutazione dell'associazione tra stato HPV e risposta terapeutica o sopravvivenza nei pazienti con SCC orofaringeo/laringeo Analisi prospettiche di serie di casi negli Stati Uniti e in Europa hanno costantemente dimostrato che i pazienti con SCC orofaringeo HPV-positivi hanno una prognosi migliore rispetto ai pazienti i cui tumori sono HPV negativi (21,22). Valuteremo l'effetto dello stato di HPV tumorale sulla risposta al trattamento e sugli esiti di sopravvivenza tra i pazienti con SCC orofaringeo e laringeo che sono stati trattati con chemioradioterapia primaria o radioterapia (regime di conservazione degli organi).

Raccolta dati Ogni centro raccoglierà i dati dalle cartelle cliniche dei pazienti. I dati includeranno: età, sesso, etnia, area di nascita e residenza, religione, istruzione (sempre frequenza scolastica, numero di anni di frequenza scolastica ed età alla fine della scuola), occupazione più lunga, consumo di tabacco nelle sue diverse forme, abitudini di consumo di alcol, abitudini alimentari, stato civile, storia sessuale (numero di partner sessuali nel corso della vita, visite a prostitute e frequenza del sesso orale), storie di varie malattie, storia familiare di cancro e salute della cavità orale. Un "fumatore" è definito come un individuo che riferisce di aver fumato tabacco quotidianamente per almeno 1 anno, e ai fumatori verrà chiesto informazioni sulla durata del fumo e sulla quantità e sul tipo di tabacco fumato (sigarette, sigari, pipe o qualsiasi forma di tabacco da masticare) . Un "bevitore" è definito come un individuo che riferisce di bere bevande alcoliche almeno una volta al mese. Saranno ottenuti dettagli su tipi di bevande, quantità e durata del consumo abituale. le informazioni sulla classificazione e la stadiazione delle metastasi linfonodali tumorali saranno ottenute dai pazienti dello studio. Questa classificazione sarà convertita in stadio secondo il Manuale di stadiazione del cancro dell'American Joint Committee on Cancer (AJCC). Valuteremo l'esito di ciascuna terapia in termini di risposta (risposta completa, risposta parziale e malattia progressiva secondo la classificazione RECIST)

Analisi statistica La sopravvivenza globale a cinque anni (OS), la sopravvivenza specifica per malattia (DSS) ei tassi di controllo locoregionale saranno calcolati utilizzando il metodo Kaplan-Meier e la differenza nel tasso di sopravvivenza sarà valutata mediante un log rank test (17). La OS sarà misurata dalla data dell'intervento chirurgico alla data del decesso o dell'ultimo follow-up. Per DSS, i pazienti deceduti per cause diverse da SCC saranno censurati al momento della morte. Le variabili che avranno potenzialità prognostiche suggerite dall'analisi univariata saranno sottoposte ad analisi multivariata con il modello di regressione dei rischi proporzionali di Cox. Tutte le statistiche saranno a due facce. Un valore di P < 0,05 sarà considerato per indicare significatività statistica. Il confronto della classificazione HPV/p16 (modello a tre classi) sarà eseguito mediante analisi di Kruskal-Wallis seguita dal test della somma dei ranghi di Wilcoxon con correzioni di Bonferroni. Il confronto dell'espressione proteica mediante classificazione HPV/p16 sarà effettuato utilizzando l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) con confronti post hoc mediante il test T3 di Dunnett. Il confronto dell'HPV - stato di classificazione del modello a tre classi con specifiche variabili cliniche e patologiche (sesso, stadio TNM, stadio T, stadio N, grado istologico, gestione, radioterapia, chemioradioterapia, uso di alcol, uso di tabacco e risposta clinica), sarà eseguito da Test esatto di Fisher. La risposta clinica verrà registrata come risposta completa rispetto a nessuna risposta/risposta parziale dopo il completamento del trattamento. Tutti i calcoli e le analisi saranno eseguiti con Statistical Package for the Social Sciences versione 11.5 per Windows (SPSS Inc, Chicago, IL), da uno statistico qualificato presso il Tel Aviv Souraky Medical Center (Esther Shabtai PhD).

Dimensione del campione e sua giustificazione La prevalenza di HNSCC in Israele è stimata in 52 nuovi casi di cancro orofaringeo e 250 laringei all'anno (Middle East cancer consorcium, www.mecc.cancer.gov). I centri medici che parteciperanno a questo studio coprono l'80% della popolazione dello Stato di Israele. stimiamo che il tasso di partecipazione tra i casi di pazienti sarà dell'89% (intervallo dal 76 al 99,0%) (REF JNCI International). Pertanto si stima che per un periodo di studio di 6 mesi verranno reclutati circa 100 campioni.