Вирус папилломы человека (ВПЧ) при плоскоклеточном раке головы и шеи (HPV)

Определить распространенность и классифицировать типы вируса папилломы человека высокого риска, связанные с раком головы и шеи в Израиле. Мы определим распространение генотипа ВПЧ в Израиле, чтобы изучить этническую уникальность региона. Многие исследования показали, что ВПЧ 16 является наиболее распространенным типом при HNSCC (NEJM). У израильских еврейских женщин наиболее распространенными генотипами были обнаружены типы ВПЧ 16, 39, 52 и 18 (15). С нашей целью мы определим распространенность различных генотипов ВПЧ в образцах ПРГШ. Исследуемая популяция В группу будут входить пациенты, получавшие первичную операцию или биопсию, с адъювантной лучевой терапией или без нее в период с 1998 по 2010 год по поводу плоскоклеточного рака полости рта, ротоглотки, гортаноглотки. , гортань и околоносовые пазухи.

Будут задокументированы анатомическая локализация и протяженность первичной опухоли. Классификация TNM будет основана на системе стадирования, пересмотренной Американским объединенным комитетом по раку (AJCC). Пациенты будут набираться из семи национальных онкологических больниц, включая Медицинский центр Сорока в Негеве (Беэр-Шева), Медицинский центр Сураски (Тель-Авив), Медицинский центр Рабина (Петах-Тиква), Медицинский центр Хадасса (Иерусалим), Медицинский центр Рамбам (Хайфа). ), медицинский центр Шиба (Рамат-Ган) и Французский госпиталь Назарет (Назарет). Эти центры охватывают почти все население Израиля, включая израильских евреев, бедуинов, друзов и израильское арабское население.

Ввод данных Данные будут введены в коммерчески доступную электронную таблицу (Microsoft Excel 2000, Microsoft Corporation, Сиэтл, Вашингтон), а статистический анализ будет выполнен с использованием пакета компьютеризированного программного обеспечения (SPSS). Ранее мы использовали аналогичную систему для сообщения результатов 146 пациентов с саркомами основания черепа в международном многоцентровом исследовании, включавшем 17 онкологических центров (17).

Образцы опухолей Образцы будут собираться ретроспективно и состоят из парафиновых срезов первичных опухолей или биопсий, извлеченных из архивов отделений патологии в каждом центре. Перевозка парафиновых блоков в Тель-Авив для депарафинизации и тестирования на ВПЧ будет осуществляться лично следователями. Гистопатологический анализ Образцы первичной опухоли будут сначала оцениваться патологоанатомами при каждом раке, участвующем в исследовании. Затем все образцы будут повторно проанализированы и оценены патологоанатомом головы и шеи, доктором Капланом Иланой. Вскрытие образца и забор ткани первичной опухоли будут проводиться в соответствии с действующими рекомендациями по гистопатологической оценке карциномы рака головы и шеи.

Выявление ВПЧ в лаборатории. Срезы тканей будут подвергаться депарафинизации, извлечению мишени, индуцированной нагреванием, и расщеплению протеиназой К (Roche Diagnostics, Индианаполис, Индиана), как описано ранее (18). Затем ДНК очищают от парафина депарафинизацией, расщеплением протеиназой К, экстракцией фенолом/хлороформом и осаждением этанолом. Мы будем использовать систему генотипирования ВПЧ с использованием набора для тестирования HPV GenoArray на основе ПЦР для генотипирования 37 тайпов ВПЧ (Hybribio Limited, Гонконг). Образцы помещают в среду PreservCytR LBC (флакон ThinPrep с жидким мазком; Cytyc Corporation). Набор для тестирования на ВПЧ Amplicor содержит набор праймеров, специфичных для ВПЧ, предназначенных для амплификации ДНК ВПЧ из 13 генотипов HR (типы 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 и 68). ). Согласно спецификации производителя, тест Amplicor HPV выявляет генотипы ВПЧ 31, 52, 58 и 59 при 240 копиях/мл и генотипы ВПЧ 16, 18, 33, 35, 39, 45, 51, 56 и 68 при 100 копиях. /мл с уровнем положительных результатов более 95%. Все генотипы выявляются со 100% положительным результатом при 480 копиях/мл.

Генотипирование ВПЧ Генотипирование ВПЧ выполняется с использованием имеющегося в продаже набора для тестирования HPV GenoArray на основе ПЦР (Hybribio Limited, Гонконг), который использует как амплификацию ДНК, так и запатентованную HybriBio технику проточной гибридизации для одновременной идентификации 21 генотипа ВПЧ, включая 5 генотипов низкого риска. типы (типы 6, 11, 42, 43 и 44), 14 типов HR (типы 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68), и 2 типа промежуточного риска (типы CP8304 и 53).

В тесте используется формат макроматрицы с нейлоновой мембраной, на которой иммобилизованы зонды олигонуклеотидов, специфичных для генотипа ВПЧ. Система гибридизации in situ будет выполнена с тестом Amplicor HPV (Roche Molecular Systems) для проверки результатов. Этот набор предназначен для обнаружения и распознавания ДНК вируса папилломы человека (ВПЧ) в тканях, залитых парафином. Положительный на ВПЧ16 образец опухоли будет использоваться в качестве положительного контроля.

p16 Иммуногистохимия

Статус экспрессии p16 сильно коррелирует со статусом ВПЧ в опухоли (19), и поэтому мы будем оценивать присутствие этого белка с помощью иммуногистохимии (20). После депарафинизации срезов размером 5 мкм проводят выделение антигена с использованием выделения эпитопов, индуцированного нагреванием, с 10 мМ цитратным буфером. Иммуноокрашивание будет проводиться с помощью автоматического красителя Ventana (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) в соответствии с рекомендациями производителя. Образец шейки матки, о котором известно, что он положительный на ВПЧ, будет использоваться в качестве положительного контроля, а нормальные ткани - в качестве исходного контроля. Будет использовано мышиное моноклональное антитело против p16 (MTM Laboratories, Heidelberg, Germany) в разведении 1:500. Антитело р16 выявляют с использованием методики авидин-биотин-пероксидазы (Dako LSAB Kit, Dako). При гистопатологическом обзоре картина экспрессии p16 обычно дихотомична в зависимости от образца опухоли, при этом окрашивание p16 либо отсутствует (отрицательный результат), либо присутствует с сильным и диффузным ядерным и цитоплазматическим окрашиванием (положительный результат). Относительная экспрессия белка будет оцениваться с использованием специального программного обеспечения (Metamorph, Molecular Devices, Union City, CA), которое анализирует интенсивность и площадь положительного окрашивания. Иммуногистохимическая интерпретация будет проводиться двумя исследователями, не имеющими представления о статусе ВПЧ и личности пациента, у которого возникла опухоль.

Оценка связи между ВПЧ-статусом и терапевтическим ответом или выживаемостью у пациентов с орофарингеальным/гортанным плоскоклеточным раком. Проспективный анализ серии случаев в США и Европе последовательно продемонстрировал, что пациенты с орофарингеальным плоскоклеточным раком, которые являются ВПЧ-позитивными, имеют лучший прогноз, чем пациенты с опухолями. являются ВПЧ-отрицательными (21,22). Мы оценим влияние ВПЧ-статуса опухоли на ответ на лечение и результаты выживаемости среди пациентов с плоскоклеточным раком ротоглотки и гортани, которым проводилась первичная химиолучевая терапия или лучевая терапия (органосохраняющий режим).

Сбор данных Каждый центр будет собирать данные из карт пациентов. Данные будут включать: возраст, пол, этническую группу, место рождения и проживания, религию, образование (посещаемость школы, количество лет посещения школы и возраст окончания школы), самую продолжительную профессию, употребление табака в различных формах. формы, привычки употребления алкоголя, пищевые привычки, семейное положение, сексуальный анамнез (количество половых партнеров в течение жизни, посещения проституток и частота орального секса), истории различных заболеваний, семейный анамнез рака и здоровье полости рта. «Курильщик» определяется как лицо, которое сообщает о ежедневном курении табака в течение как минимум 1 года, и курильщикам будет задан вопрос о продолжительности курения, количестве и типе выкуриваемого табака (сигареты, сигары, трубка или любая форма жевания табака). . «Пьющий» определяется как человек, который сообщает об употреблении алкогольных напитков не реже одного раза в месяц. Будет получена подробная информация о типах напитков, количестве и продолжительности обычного употребления алкоголя. информация о классификации опухолевого узла и метастазах будет получена от пациентов исследования. Эта классификация будет преобразована в стадии в соответствии с Руководством по стадированию рака Американского объединенного комитета по раку (AJCC). Мы будем оценивать результат каждой терапии с точки зрения ответа (полный ответ, частичный ответ и прогрессирование заболевания в соответствии с классификацией RECIST).

Статистический анализ Пятилетняя общая выживаемость (ОВ), выживаемость по конкретным заболеваниям (DSS) и локорегиональный контроль будут рассчитываться с использованием метода Каплана-Мейера, а разница в выживаемости будет оцениваться с помощью логарифмического рангового теста (17). OS будет измеряться от даты операции до даты смерти или последнего наблюдения. Для DSS пациенты, умершие от причин, отличных от SCC, будут подвергаться цензуре в момент смерти. Переменные, которые будут иметь прогностический потенциал, предложенный одномерным анализом, будут подвергнуты многомерному анализу с помощью регрессионной модели пропорциональных рисков Кокса. Вся статистика будет двусторонней. Значение P<0,05 будет считаться показателем статистической значимости. Сравнение классификации HPV/p16 (трехклассовая модель) будет выполнено с помощью анализа Крускала-Уоллиса с последующим критерием суммы рангов Уилкоксона с поправками Бонферрони. Сравнение экспрессии белка по классификации HPV/p16 будет выполнено с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с апостериорными сравнениями с помощью критерия Dunnett T3. Сравнение статуса ВПЧ по трем классам модели с конкретными клиническими и патологическими переменными (пол, стадия TNM, стадия T, стадия N, гистологическая степень, лечение, лучевая терапия, химиолучевая терапия, употребление алкоголя, употребление табака и клинический ответ) будет выполнено Точный критерий Фишера. Клинический ответ будет зарегистрирован как полный ответ по сравнению с отсутствием ответа/частичным ответом после завершения лечения. Все расчеты и анализы будут выполняться с помощью Статистического пакета для социальных наук версии 11.5 для Windows (SPSS Inc, Чикаго, Иллинойс) квалифицированным статистиком из Тель-Авивского медицинского центра Суракы (доктор философии Эстер Шабтай).

Размер выборки и его обоснование Распространенность HNSCC в Израиле оценивается в 52 новых случая рака ротоглотки и 250 новых случаев рака гортани в год (Middle East Cancer Consorcium, www.mecc.cancer.gov). Медицинские центры, которые будут участвовать в этом исследовании, охватывают 80% населения Государства Израиль. по нашим оценкам, уровень участия среди больных составит 89% (диапазон от 76 до 99,0%) (REF JNCI International). Таким образом, предполагается, что за период исследования в 6 месяцев будет отобрано около 100 образцов.