Virus del Papiloma Humano (VPH) en Carcinoma de Células Escamosas de Cabeza y Cuello (HPV)

Determinar la prevalencia y clasificar los tipos de virus del papiloma humano de alto riesgo asociados con el cáncer de cabeza y cuello en Israel. Determinaremos la distribución del genotipo del VPH en Israel para estudiar la singularidad étnica de la región. Muchos estudios han demostrado que el VPH 16 es el tipo más frecuente en HNSCC (NEJM). En las mujeres judías israelíes, los tipos de VPH 16, 39, 52 y 18 fueron los genotipos más prevalentes encontrados (15). En nuestro objetivo, determinaremos la prevalencia de varios genotipos de VPH en muestras de HNSCC. Población de estudio El grupo incluirá pacientes tratados con cirugía primaria o biopsia, con o sin radioterapia adyuvante entre 1998 y 2010 para SCC de la cavidad oral, orofaringe, hipofaringe , laringe y senos paranasales.

Se documentará el sitio anatómico y la extensión del tumor primario. La clasificación TNM de se basará en el sistema de estadificación revisado por el Comité Conjunto Estadounidense sobre el Cáncer (AJCC). Los pacientes serán reclutados de siete hospitales nacionales de referencia de cáncer, incluido el Centro Médico Soroka en el Negev (Beer Sheva), el Centro Médico Sourasky (Tel Aviv), el Centro Médico Rabin (Petach Tikva), el Centro Médico Hadassa (Jerusalén), el Centro Médico Rambam (Haifa ), el centro médico Sheba (Ramat-Gan) y el French Hospital Nazareth (Nazareth). Estos centros cubren a casi toda la población de Israel, incluidos los judíos israelíes, los beduinos, los drusos y la población árabe israelí.

Ingreso de datos Los datos se ingresarán en una hoja de cálculo comercialmente disponible (Microsoft Excel 2000, Microsoft Corporation, Seattle, WA) y se realizará un análisis estadístico utilizando un paquete de software computarizado (SPSS). Anteriormente, usamos un sistema similar para informar los resultados de 146 pacientes con sarcomas en la base del cráneo en un estudio multicéntrico internacional que incluyó 17 centros oncológicos (17).

Especímenes de tumores Los especímenes se recolectarán retrospectivamente y constan de secciones en parafina de tumores primarios o biopsias recuperadas de los archivos del departamento de patología de cada centro. El transporte de bloques de parafina a Tel Aviv para la desparafinación y la prueba de VPH se realizará personalmente por parte de los investigadores. Análisis histopatológico Los especímenes de tumores primarios serán evaluados primero por patólogos en cada cáncer participante. Todos los especímenes serán luego re-analizados y evaluados por el patólogo de cabeza y cuello, Dr. Kaplan Ilana. La disección de la muestra y el muestreo de tejido del tumor primario se realizarán de acuerdo con las pautas actuales para la evaluación histopatológica del carcinoma de cáncer de cabeza y cuello.

Detección de VPH en el laboratorio Las secciones de tejido se someterán a desparafinización, recuperación de diana inducida por calor y digestión con proteinasa K (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN), como se describió anteriormente (18). A continuación, el ADN se purifica de la parafina mediante desparafinización, digestión con proteinasa K, extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol. Usaremos el sistema de genotipado de VPH utilizando un kit de prueba HPV GenoArray basado en PCR para el genotipado de 37 tipos de VPH (Hybribio Limited, Hong Kong). Las muestras se colocan en medio PreservCytR LBC (vial de Pap líquido ThinPrep; Cytyc Corporation). El kit de prueba Amplicor HPV contiene un conjunto de cebadores específicos de HPV diseñados para amplificar el ADN de HPV de 13 genotipos HR (tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68 ). De acuerdo con las especificaciones del fabricante, la prueba Amplicor HPV detecta los genotipos de VPH 31, 52, 58 y 59 a 240 copias/ml y los genotipos de VPH 16, 18, 33, 35, 39, 45, 51, 56 y 68 a 100 copias. /ml con una tasa de positividad superior al 95%. Todos los genotipos se detectan con una tasa de positividad del 100 % a 480 copias/ml.

Genotipado de VPH El genotipado de VPH se realiza mediante el uso de un kit de prueba HPV GenoArray basado en PCR disponible en el mercado (Hybribio Limited, Hong Kong), que utiliza tanto la amplificación de ADN como la técnica de hibridación de flujo continuo patentada de HybriBio para identificar simultáneamente 21 genotipos de VPH, incluidos 5 de bajo riesgo. (tipos 6, 11, 42, 43 y 44), 14 tipos HR (tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68), y 2 tipos de riesgo intermedio (tipos CP8304 y 53).

La prueba emplea un formato de macromatriz con una membrana de nailon en la que se han inmovilizado sondas de oligonucleótidos específicos del genotipo del VPH. El sistema de hibridación in situ se realizará con la prueba Amplicor HPV (Roche Molecular Systems) para la validación de los resultados. Este kit está diseñado para la detección y discriminación del ADN del virus del papiloma humano (VPH) en tejido incluido en parafina. Se utilizará una muestra de tumor HPV16-positiva como control positivo.

p16 Inmunohistoquímica

El estado de expresión de p16 está fuertemente correlacionado con el estado de VPH del tumor (19) y, por lo tanto, evaluaremos la presencia de esta proteína mediante inmunohistoquímica (20). Después de desparafinar secciones de 5 μm, la recuperación del antígeno se realiza mediante el uso de la recuperación del epítopo inducida por calor con tampón de citrato 10 mM. La inmunotinción se realizará con un sistema de tinción automatizado Ventana (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La muestra cervical que se sabe que es positiva para el VPH se utilizará como control positivo y los tejidos normales como controles de referencia. Se utilizará un anticuerpo monoclonal de ratón contra p16 (MTM Laboratories, Heidelberg, Alemania) a una dilución de 1:500. El anticuerpo p16 se detecta mediante la técnica de avidina-biotina-peroxidasa (Dako LSAB Kit, Dako). En la revisión histopatológica, el patrón de expresión de p16 generalmente es dicotómico según la muestra del tumor, con tinción de p16 ausente (negativa) o presente con tinción nuclear y citoplasmática fuerte y difusa (positiva). La expresión relativa de proteínas se estimará utilizando un software dedicado (Metamorph, Molecular Devices, Union City, CA), que analizó la intensidad y el área de tinción positiva. La interpretación inmunohistoquímica será realizada por dos investigadores que desconocían el estado del VPH y la identidad del paciente del que se originó el tumor.

Evaluación de la asociación entre el estado del VPH y la respuesta terapéutica o la supervivencia en pacientes con SCC orofaríngeo/laríngeo Los análisis prospectivos de series de casos en los Estados Unidos y Europa han demostrado consistentemente que los pacientes con SCC orofaríngeo que son VPH positivos tienen un mejor pronóstico que los pacientes cuyos tumores son VPH negativos (21,22). Evaluaremos el efecto del estado del VPH del tumor sobre la respuesta al tratamiento y los resultados de supervivencia entre los pacientes con SCC de orofaringe y laringe que fueron tratados con quimiorradioterapia primaria o radioterapia (régimen de preservación de órganos).

Recopilación de datos Cada centro recopilará datos de las historias clínicas de los pacientes. Los datos incluirán: edad, sexo, grupo étnico, área de nacimiento y residencia, religión, educación (asistencia a la escuela alguna vez, número de años de asistencia a la escuela y edad al dejar la escuela), ocupación más larga, uso de tabaco en sus diferentes formas, hábitos de consumo de alcohol, hábitos dietéticos, estado civil, antecedentes sexuales (número de parejas sexuales a lo largo de la vida, visitas a prostitutas y frecuencia del sexo oral), antecedentes de diversas enfermedades, antecedentes familiares de cáncer y salud de la cavidad bucal. Un "fumador" se define como una persona que informa haber fumado tabaco diariamente durante al menos 1 año, y se les preguntará a los fumadores sobre la duración del hábito de fumar y la cantidad y el tipo de tabaco fumado (cigarrillos, puros, pipas o cualquier forma de tabaco para mascar) . Un "bebedor" se define como una persona que informa beber bebidas alcohólicas al menos una vez al mes. Se obtendrán detalles sobre tipos de bebidas, cantidades y duración del consumo habitual. la información sobre la clasificación y estadificación de metástasis en ganglios tumorales se obtendrá de los pacientes del estudio. Esta clasificación se convertirá en estadio de acuerdo con el Manual de estadificación del cáncer del American Joint Committee on Cancer (AJCC). Evaluaremos el resultado de cada terapia en términos de respuesta (respuesta completa, respuesta parcial y progresión de la enfermedad según la clasificación RECIST)

Análisis estadístico Las tasas de supervivencia global (SG) a cinco años, supervivencia específica de la enfermedad (DSS) y control locorregional se calcularán utilizando el método de Kaplan-Meier y la diferencia en la tasa de supervivencia se evaluará mediante una prueba de rango logarítmico (17). La OS se medirá desde la fecha de la cirugía hasta la fecha de la muerte o el último seguimiento. Para DSS, los pacientes que fallecieron por causas distintas al SCC serán censurados en el momento de la muerte. Las variables que tendrán potencial pronóstico sugerido por el análisis univariado se someterán a un análisis multivariado con el modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox. Todas las estadísticas serán de dos caras. Se considerará un valor de P < 0,05 para indicar significancia estadística. La comparación de la clasificación de HPV/p16 (modelo de tres clases) se realizará mediante el análisis de Kruskal-Wallis seguido de la prueba de suma de rangos de Wilcoxon con correcciones de Bonferroni. La comparación de la expresión de la proteína por clasificación de HPV/p16 se realizará utilizando un análisis de varianza de una vía (ANOVA) con comparaciones post hoc mediante la prueba T3 de Dunnett. La comparación del estado de clasificación del modelo de tres clases de VPH con variables clínicas y patológicas específicas (sexo, estadio TNM, estadio T, estadio N, grado histológico, manejo, radioterapia, quimiorradiación, consumo de alcohol, consumo de tabaco y respuesta clínica) será realizada por Prueba exacta de Fisher. La respuesta clínica se registrará como respuesta completa versus sin respuesta/respuesta parcial después de completar el tratamiento. Todos los cálculos y análisis se realizarán con el Paquete Estadístico para Ciencias Sociales versión 11.5 para Windows (SPSS Inc, Chicago, IL), por un estadístico calificado en Tel Aviv Souraky Medical Center (Esther Shabtai PhD).

Tamaño de la muestra y su justificación La prevalencia de HNSCC en Israel se estima en 52 casos nuevos de cáncer de orofaringe y 250 de laringe por año (Consorcio de cáncer de Oriente Medio, www.mecc.cancer.gov). Los centros médicos que participarán en este estudio cubren el 80% de la población del Estado de Israel. estimamos que la tasa de participación entre los casos de pacientes será del 89% (rango de 76 a 99,0%) (REF JNCI International). Por lo tanto se estima un periodo de estudio de 6 meses se reclutarán aproximadamente 100 muestras.