Wirus brodawczaka ludzkiego (HPV) w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi (HPV)

Aby określić częstość występowania i sklasyfikować typy wirusa brodawczaka ludzkiego wysokiego ryzyka związane z rakiem głowy i szyi w Izraelu. Określimy rozmieszczenie genotypów HPV w Izraelu, aby zbadać wyjątkowość etniczną tego regionu. Wiele badań wykazało, że HPV 16 jest najbardziej rozpowszechnionym typem w HNSCC (NEJM). U izraelskich Żydówek typy 16, 39, 52 i 18 HPV były najczęściej występującymi genotypami (15). Naszym celem będzie określenie częstości występowania różnych genotypów HPV w próbkach HNSCC. Populacja badana Grupa obejmie pacjentów leczonych pierwotną operacją lub biopsją z radioterapią uzupełniającą lub bez w latach 1998-2010 z powodu SCC jamy ustnej, części ustnej gardła, gardła dolnego , krtani i zatok przynosowych.

Udokumentowane zostanie umiejscowienie anatomiczne i rozległość guza pierwotnego. Klasyfikacja TNM będzie oparta na systemie stopniowania zmienionym przez American Joint Committee on Cancer (AJCC). Pacjenci będą rekrutowani z siedmiu krajowych szpitali onkologicznych, w tym z Centrum Medycznego Soroka w Negewie (Beer Szewa), Centrum Medycznego Sourasky (Tel Awiw), Centrum Medycznego Rabin (Petach Tikva), Centrum Medycznego Hadassa (Jerozolima), Centrum Medycznego Rambam (Hajfa). ), Centrum Medyczne Szeba (Ramat-Gan) i Francuski Szpital Nazaret (Nazaret). Ośrodki te obejmują niemal całą populację Izraela, w tym Żydów izraelskich, Beduinów, Druzów oraz ludność izraelską Arabów.

Wprowadzanie danych Dane zostaną wprowadzone do dostępnego na rynku arkusza kalkulacyjnego (Microsoft Excel 2000, Microsoft Corporation, Seattle, WA), a analiza statystyczna zostanie przeprowadzona przy użyciu pakietu oprogramowania komputerowego (SPSS). Wcześniej używaliśmy podobnego systemu do zgłaszania wyników 146 pacjentów z mięsakami podstawy czaszki w międzynarodowym wieloośrodkowym badaniu obejmującym 17 ośrodków onkologicznych (17).

Próbki guzów Próbki będą pobierane retrospektywnie i będą składać się ze skrawków parafinowych pierwotnych guzów lub biopsji pobranych z archiwów działów patologii w każdym ośrodku. Transport bloczków parafinowych do Tel Awiwu w celu deparafinizacji i badań HPV odbędzie się osobiście przez badaczy. Analiza histopatologiczna Próbki guza pierwotnego zostaną najpierw ocenione przez patologów w przypadku każdego nowotworu biorącego udział w badaniu. Wszystkie próbki zostaną następnie ponownie przeanalizowane i ocenione przez patologa głowy i szyi, dr Kaplana Ilanę. Dyssekcja i pobieranie próbek tkanki guza pierwotnego będą zgodne z aktualnymi wytycznymi dotyczącymi oceny histopatologicznej raka głowy i szyi.

Wykrywanie HPV w laboratorium Skrawki tkanek zostaną poddane odparafinowaniu, wywołanemu ciepłem odnalezieniu celu i trawieniu proteinazą K (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), jak opisano wcześniej (18). DNA jest następnie oczyszczane z parafiny przez odparafinowanie, trawienie proteinazą K, ekstrakcję fenolem/chloroformem i wytrącanie etanolem. Użyjemy systemu genotypowania HPV przy użyciu zestawu testowego HPV GenoArray opartego na PCR do genotypowania 37 taypes HPV (Hybribio Limited, Hong Kong). Próbki umieszcza się w podłożu PreservCytR LBC (fiolka ThinPrep Liquid Pap; Cytyc Corporation). Zestaw testowy Amplicor HPV zawiera pulę starterów specyficznych dla HPV przeznaczonych do amplifikacji DNA HPV z 13 genotypów HR (typy 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 i 68 ). Zgodnie z zaleceniami producenta test Amplicor HPV wykrywa genotypy HPV 31, 52, 58 i 59 w 240 kopiach/ml oraz genotypy HPV 16, 18, 33, 35, 39, 45, 51, 56 i 68 w 100 kopiach /ml ze wskaźnikiem dodatnim większym niż 95%. Wszystkie genotypy są wykrywane ze 100% wskaźnikiem pozytywności przy 480 kopiach/ml.

Genotypowanie HPV Genotypowanie HPV przeprowadza się przy użyciu dostępnego w handlu zestawu HPV GenoArray opartego na PCR (Hybribio Limited, Hong Kong), który wykorzystuje zarówno amplifikację DNA, jak i zastrzeżoną technikę hybrydyzacji przepływowej HybriBio w celu jednoczesnej identyfikacji 21 genotypów HPV, w tym 5 genotypów niskiego ryzyka typy (typy 6, 11, 42, 43 i 44), 14 typów HR (typy 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 i 68), oraz 2 typy o średnim ryzyku (typy CP8304 i 53).

Test wykorzystuje format makromacierzy z nylonową membraną, na której unieruchomiono sondy oligonukleotydowe specyficzne dla genotypu HPV. System Hybrydyzacji In Situ zostanie przeprowadzony z testem Amplicor HPV (Roche Molecular Systems) w celu walidacji wyników. Ten zestaw jest przeznaczony do wykrywania i rozróżniania DNA wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV) w tkance zatopionej w parafinie. Próbka guza HPV16-dodatniego zostanie użyta jako kontrola pozytywna.

p16 Immunohistochemia

Status ekspresji p16 jest silnie skorelowany ze statusem HPV guza (19) i dlatego będziemy oceniać obecność tego białka za pomocą immunohistochemii (20). Po odparafinowaniu skrawków o grubości 5 µm, przeprowadza się odzyskiwanie antygenu za pomocą wywołanego ciepłem odzyskiwania epitopów z 10 mM buforem cytrynianowym. Immunobarwienie zostanie przeprowadzone za pomocą automatycznego urządzenia do barwienia firmy Ventana (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) zgodnie z zaleceniami producenta. Próbka z szyjki macicy, o której wiadomo, że jest dodatnia w kierunku HPV, zostanie wykorzystana jako kontrola pozytywna, a normalne tkanki jako kontrola wyjściowa. Wykorzystane zostanie mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko p16 (MTM Laboratories, Heidelberg, Niemcy) w rozcieńczeniu 1:500. Przeciwciało p16 wykrywa się stosując technikę awidyna-biotyna-peroksydaza (zestaw Dako LSAB, Dako). W przeglądzie histopatologicznym wzór ekspresji p16 jest generalnie dychotomiczny w zależności od próbki guza, z barwieniem p16 albo nieobecnym (ujemne), albo obecnym z silnym i rozproszonym barwieniem jądrowym i cytoplazmatycznym (pozytywne). Względna ekspresja białka zostanie oszacowana przy użyciu dedykowanego oprogramowania (Metamorph, Molecular Devices, Union City, CA), które przeanalizowało intensywność i obszar pozytywnego barwienia. Interpretacja immunohistochemiczna zostanie przeprowadzona przez dwóch badaczy, którzy nie znają statusu HPV i tożsamości pacjenta, od którego pochodzi guz.

Ocena związku między statusem HPV a odpowiedzią terapeutyczną lub przeżyciem u pacjentów z SCC jamy ustnej i gardła/krtani Prospektywne analizy serii przypadków w Stanach Zjednoczonych i Europie konsekwentnie wykazały, że pacjenci z SCC jamy ustnej i gardła, którzy są HPV-dodatni, mają lepsze rokowanie niż pacjenci, u których guzy są HPV-ujemne (21,22). Ocenimy wpływ statusu HPV guza na odpowiedź na leczenie i wyniki przeżycia wśród pacjentów z SCC jamy ustnej i gardła i krtani, którzy byli leczeni pierwotną chemioradioterapią lub radioterapią (reżim oszczędzania narządów).

Gromadzenie danych Każdy ośrodek będzie zbierał dane z kart pacjentów. Dane będą obejmować: wiek, płeć, przynależność etniczną, miejsce urodzenia i zamieszkania, religię, wykształcenie (staż chodzenia do szkoły, liczbę lat uczęszczania do szkoły oraz wiek ukończenia szkoły), najdłuższy staż zawodowy, używanie tytoniu w różnych formy, nawyki związane z piciem alkoholu, zwyczaje żywieniowe, stan cywilny, historię seksualną (liczba partnerów seksualnych w życiu, wizyty u prostytutek i częstotliwość seksu oralnego), historię różnych chorób, rodzinną historię chorób nowotworowych, stan jamy ustnej. „Palacz” definiuje się jako osobę, która twierdzi, że paliła tytoń codziennie przez co najmniej 1 rok, a palacze zostaną zapytani o czas trwania palenia oraz ilość i rodzaj wypalanego tytoniu (papierosy, cygara, fajki lub jakakolwiek forma tytoniu do żucia) . „Pijącego” definiuje się jako osobę, która zgłasza picie napojów alkoholowych co najmniej raz w miesiącu. Uzyskane zostaną szczegółowe informacje na temat rodzajów napojów, ilości i czasu trwania zwyczajowego picia. informacje na temat klasyfikacji przerzutów do węzłów guza i stopnia zaawansowania zostaną uzyskane od pacjentów uczestniczących w badaniu. Ta klasyfikacja zostanie przekształcona w etap zgodnie z podręcznikiem stopniowania raka Amerykańskiego Wspólnego Komitetu ds. Raka (AJCC). Ocenimy wynik każdej terapii pod kątem odpowiedzi (odpowiedź całkowita, odpowiedź częściowa i postęp choroby według klasyfikacji RECIST)

Analiza statystyczna Pięcioletnie przeżycie całkowite (OS), przeżywalność specyficzna dla choroby (DSS) i wskaźniki kontroli lokoregionalnej zostaną obliczone przy użyciu metody Kaplana-Meiera, a różnica we współczynniku przeżycia zostanie oceniona za pomocą testu logarytmicznego rang (17). OS będzie mierzone od daty operacji do daty śmierci lub ostatniej wizyty kontrolnej. W przypadku DSS pacjenci, którzy zmarli z przyczyn innych niż SCC, zostaną ocenzurowani w chwili śmierci. Zmienne, które będą miały potencjał prognostyczny sugerowany przez analizę jednoczynnikową, zostaną poddane analizie wielowymiarowej z wykorzystaniem modelu regresji proporcjonalnego hazardu Coxa. Wszystkie statystyki będą dwustronne. Wartość P < 0,05 będzie uważana za wskazującą istotność statystyczną. Porównanie klasyfikacji HPV/p16 (model trójklasowy) zostanie przeprowadzone za pomocą analizy Kruskala-Wallisa, a następnie testu sumy rang Wilcoxona z poprawkami Bonferroniego. Porównanie ekspresji białka według klasyfikacji HPV/p16 zostanie wykonane przy użyciu jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) z porównaniami post hoc za pomocą testu T3 Dunnetta. Porównanie statusu klasyfikacji modelu HPV w trzech klasach z określonymi zmiennymi klinicznymi i patologicznymi (płeć, stadium TNM, stadium T, stadium N, stopień złośliwości histologicznej, postępowanie, radioterapia, radiochemioterapia, spożywanie alkoholu, palenie tytoniu i odpowiedź kliniczna) zostanie przeprowadzone przez Dokładny test Fishera. Odpowiedź kliniczna zostanie zarejestrowana jako całkowita odpowiedź w porównaniu z brakiem odpowiedzi/częściową odpowiedzią po zakończeniu leczenia. Wszystkie obliczenia i analizy zostaną wykonane za pomocą Statistical Package for the Social Sciences w wersji 11.5 dla Windows (SPSS Inc, Chicago, IL), przez wykwalifikowanego statystyka z Tel Aviv Souraky Medical Center (dr Esther Shabtai).

Wielkość próby i jej uzasadnienie Częstość występowania HNSCC w Izraelu szacuje się na 52 nowe przypadki raka jamy ustnej i gardła oraz 250 nowych przypadków raka krtani rocznie (Middle East Cancer Consorcium, www.mecc.cancer.gov). Ośrodki medyczne, które wezmą udział w tym badaniu obejmują 80% populacji Państwa Izrael. szacujemy, że wskaźnik uczestnictwa wśród pacjentów z przypadkiem wyniesie 89% (zakres od 76 do 99,0%) (REF JNCI International). W związku z tym szacuje się, że w ciągu 6 miesięcy zostanie zrekrutowanych około 100 próbek.