Humant papillomavirus (HPV) i planocellulært karcinom i hoved og hals (HPV)

At bestemme prævalensen og klassificere de højrisiko humane papillomavirustyper forbundet med hoved- og halskræft i Israel. Vi vil bestemme HPV-genotypefordelingen i Israel for at studere regionens etniske unikke karakter. Mange undersøgelser har vist, at HPV 16 er den mest udbredte type i HNSCC (NEJM). Hos israelske jødiske kvinder var HPV-typerne 16, 39, 52 og 18 de mest udbredte genotyper fundet (15). I vores mål vil vi bestemme prævalensen af ​​forskellige HPV-genotyper i HNSCC-prøver. Undersøgelsespopulation Gruppen vil omfatte patienter behandlet med primær kirurgi eller biopsi, med eller uden adjuverende strålebehandling mellem 1998 og 2010 for SCC i mundhulen, oropharynx, hypopharynx , larynx og paranasale bihuler.

Det anatomiske sted og omfanget af den primære tumor vil blive dokumenteret. TNM-klassificeringen af ​​vil være baseret på iscenesættelsessystemet, der er revideret af American Joint Committee on Cancer (AJCC). Patienter vil blive rekrutteret fra syv nationale kræfthenvisningshospitaler, herunder Soroka Medical Center i Negev (Beer Sheva), Sourasky Medical Center (Tel Aviv), Rabin Medical Center (Petach Tikva), Hadassa Medical (Jerusalem), Rambam Medical Center (Haifa) ), Sheba lægecenter (Ramat-Gan) og French Hospital Nazareth (Nazareth). Disse centre dækker næsten hele befolkningen i Israel, inklusive israelske jøder, beduiner, drusere og israelsk arabisk befolkning.

Dataindtastning Data vil blive indtastet i et kommercielt tilgængeligt regneark (Microsoft Excel 2000, Microsoft Corporation, Seattle, WA), og statistisk analyse vil blive udført ved hjælp af en computeriseret softwarepakke (SPSS). Vi har tidligere brugt et lignende system til at rapportere resultaterne af 146 patienter med kraniebase-sarkomer i et internationalt multicenterstudie med 17 cancercentre (17).

Tumorprøver Prøver vil blive indsamlet retrospektivt og består af paraffinsnit af primære tumorer eller biopsier hentet fra patologiafdelingens arkiver på hvert center. Transport af paraffinblokke til Tel Aviv til deparafinisering og HPV-test vil finde sted personligt af efterforskerne. Histopatologisk analyse Primære tumorprøver vil først blive evalueret af patologer ved hver deltagende cancer. Alle prøver vil derefter blive genanalyseret og evalueret af hoved- og halspatolog, Dr. Kaplan Ilana. Prøvedissektion og vævsprøvetagning af den primære tumor vil være i overensstemmelse med de gældende retningslinjer for histopatologisk vurdering af hoved- og halscancercarcinom.

HPV-detektion på laboratoriet Vævssektioner vil blive udsat for afparaffinisering, varmeinduceret måludvinding og fordøjelse med proteinase K (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), som beskrevet tidligere (18). DNA oprenses derefter fra paraffin ved afparaffinisering, proteinase K-fordøjelse, phenol/chloroform-ekstraktion og ethanoludfældning. Vi vil bruge HPV-genotypesystemet ved hjælp af et PCR-baseret HPV GenoArray-testkit til genotypebestemmelse af 37 HPV-tayper (Hybribio Limited, Hong Kong). Prøver placeres i PreservCytR LBC-medium (ThinPrep liquid Pap-hætteglas; Cytyc Corporation). Amplicor HPV-testsættet indeholder en pulje af HPV-specifikke primere designet til at amplificere HPV-DNA fra 13 HR-genotyper (type 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 og 68 ). Ifølge producentens specifikationer detekterer Amplicor HPV-testen HPV-genotyper 31, 52, 58 og 59 ved 240 kopier/ml og HPV-genotyper 16, 18, 33, 35, 39, 45, 51, 56 og 68 ved 100 kopier /ml med en positivitetsrate på mere end 95 %. Alle genotyper detekteres med en 100 % positivitetsrate ved 480 kopier/ml.

HPV-genotypning HPV-genotypning udføres ved at bruge et kommercielt tilgængeligt PCR-baseret HPV GenoArray-testkit (Hybribio Limited, Hong Kong), som gør brug af både DNA-amplifikation og HybriBio's proprietære flow-through-hybridiseringsteknik til samtidig at identificere 21 HPV-genotyper, herunder 5 lavrisiko- typer (type 6, 11, 42, 43 og 44), 14 HR-typer (type 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 og 68), og 2 mellemrisikotyper (type CP8304 og 53).

Testen anvender et makroarray-format med en nylonmembran, hvorpå HPV-genotype-specifikke oligonukleotidprober er blevet immobiliseret. In Situ Hybridization system vil blive udført med Amplicor HPV test (Roche Molecular Systems) for validering af resultaterne. Dette kit er designet til påvisning og skelnen af ​​humant papillomavirus (HPV) DNA i paraffinindlejret væv. En HPV16-positiv tumorprøve vil blive brugt som en positiv kontrol.

p16 Immunhistokemi

Ekspressionsstatus for p16 er stærkt korreleret med tumor HPV-status (19), og derfor vil vi evaluere tilstedeværelsen af ​​dette protein ved immunhistokemi (20). Efter at 5-μm sektioner er afparaffineret, udføres antigenudvinding ved brug af varmeinduceret epitopudvinding med 10 mM citratbuffer. Immunfarvning vil blive udført med en Ventana automatiseret farvning (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) i henhold til producentens anbefalinger. Cervikalprøve, der vides at være positiv for HPV, vil blive brugt som positiv kontrol og normalt væv som baseline-kontroller. Et monoklonalt museantistof mod p16 (MTM Laboratories, Heidelberg, Tyskland) ved 1:500 fortynding vil blive anvendt. p16-antistoffet påvises ved anvendelse af avidin-biotin-peroxidase-teknikken (Dako LSAB Kit, Dako). Ved histopatologisk gennemgang er mønsteret af p16-ekspression generelt dikotomt i henhold til tumorprøven, hvor p16-farvning enten er fraværende (negativ) eller til stede med stærk og diffus nuklear og cytoplasmatisk farvning (positiv). Relativ proteinekspression vil blive estimeret ved hjælp af dedikeret software (Metamorph, Molecular Devices, Union City, CA), som analyserede intensiteten og området af positiv farvning. Immunhistokemisk fortolkning vil blive udført af to efterforskere, der er blindet for HPV-status og identiteten af ​​den patient, hvorfra tumoren stammer fra.

Evaluering af sammenhængen mellem HPV-status og terapeutisk respons eller overlevelse hos patienter med oropharyngeal/laryngeal SCC Prospektive analyser af caseserier i USA og Europa har konsekvent vist, at patienter med oropharyngeal SCC, som er HPV-positive, har en bedre prognose end patienter med tumorer er HPV-negative (21,22). Vi vil evaluere effekten af ​​tumor HPV-status på behandlingsrespons og overlevelsesresultater blandt patienter med oropharyngeal og larynx SCC, som blev behandlet med primær kemoradiation eller strålebehandling (organkonserveringsregime).

Dataindsamling Hvert center vil indsamle data fra patientdiagrammer. Dataene vil omfatte: alder, køn, etnisk gruppe, føde- og bopælsområde, religion, uddannelse (ophold i skole, antal års skolegang og alder ved at forlade skolen), længste erhverv, brug af tobak i dets forskellige former, alkoholdrikkevaner, kostvaner, civilstand, seksuel historie (antal livslange seksuelle partnere, besøg hos prostituerede og hyppighed af oralsex), historier om forskellige sygdomme, familiehistorie med kræft og mundhulens sundhed. En "ryger" er defineret som en person, der rapporterer at have røget tobak dagligt i mindst 1 år, og rygere vil blive spurgt om varigheden af ​​rygning og mængden og typen af ​​røget tobak (cigaretter, cigarer, piber eller enhver form for tobakstygning) . En "drikker" er defineret som en person, der rapporterer at drikke alkoholiske drikkevarer mindst en gang om måneden. Der vil blive indhentet oplysninger om typer af drikkevarer, mængder og varighed af sædvanligt drikkeri. information om tumor-node-metastase klassificering og stadieinddeling vil blive indhentet fra undersøgelsespatienterne. Denne klassifikation vil blive konverteret til etape i henhold til American Joint Committee on Cancer (AJCC) Cancer Staging Manual. Vi vil evaluere resultatet af hver terapi i form af respons (komplet respons, delvis respons og progressiv sygdom i henhold til RECIST-klassifikationen)

Statistisk analyse Fem-års samlet overlevelse (OS), sygdomsspecifik overlevelse al (DSS) og lokoregionale kontrolrater vil blive beregnet ved hjælp af Kaplan-Meier metoden, og forskellen i overlevelsesrate vil blive vurderet ved en log rank test (17). OS vil blive målt fra datoen for operationen til datoen for døden eller sidste opfølgning. For DSS vil de patienter, der døde af andre årsager end SCC, blive censureret på dødstidspunktet. De variabler, der vil have prognostisk potentiale foreslået af univariat analyse, vil blive udsat for multivariat analyse med Cox proportional hazards regressionsmodel. Al statistik vil være tosidet. En værdi på P< 0,05 vil blive anset for at angive statistisk signifikans. Sammenligning af HPV/p16 klassificering (tre-klasse model) vil blive udført ved Kruskal-Wallis analyse efterfulgt af Wilcoxon rangsum test med Bonferroni korrektioner. Sammenligning af proteinekspression ved HPV/p16-klassificering vil blive foretaget ved hjælp af envejsvariansanalyse (ANOVA) med post hoc-sammenligninger ved Dunnetts T3-test. Sammenligning af HPV - status for tre klassemodeller med specifikke kliniske og patologiske variabler (køn, TNM-stadium, T-stadium, N-stadium, histologisk grad, behandling, strålebehandling, kemoradiation, alkoholbrug, tobaksbrug og klinisk respons), vil blive udført af Fishers nøjagtige test. Klinisk respons vil blive registreret som fuldstændig respons versus ingen respons/delvis respons efter afslutning af behandlingen. Alle beregninger og analyser vil blive udført med Statistical Package for the Social Sciences version 11.5 til Windows (SPSS Inc, Chicago, IL), af en kvalificeret statistiker ved Tel Aviv Souraky Medical Center (Esther Shabtai PhD).

Prøvestørrelse og dens begrundelse Forekomsten af ​​HNSCC i Israel anslås til at være 52 nye tilfælde af oropharynx- og 250 nye tilfælde af larynxcancer om året (Cancerconsortium i Mellemøsten, www.mecc.cancer.gov). De medicinske centre, der vil deltage i denne undersøgelse, dækker 80% af befolkningen i staten Israel. vi vurderer, at deltagelsesraten blandt casepatienter vil være 89% (spænder fra 76 til 99,0%) (REF JNCI International). Derfor anslås det, at en undersøgelsesperiode på 6 måneder vil blive rekrutteret omkring 100 prøver.