Humanes Papillomavirus (HPV) beim Plattenepithelkarzinom des Kopfes und Halses (HPV)

Bestimmung der Prävalenz und Klassifizierung der humanen Papillomavirus-Typen mit hohem Risiko, die in Israel mit Kopf- und Halskrebs in Zusammenhang stehen. Wir werden die HPV-Genotypverteilung in Israel bestimmen, um die ethnische Einzigartigkeit der Region zu untersuchen. Viele Studien haben gezeigt, dass HPV 16 der häufigste Typ bei HNSCC (NEJM) ist. Bei israelisch-jüdischen Frauen waren die HPV-Typen 16, 39, 52 und 18 die am häufigsten gefundenen Genotypen (15). In unserem Ziel werden wir die Prävalenz verschiedener HPV-Genotypen in HNSCC-Proben bestimmen. Studienpopulation Die Gruppe umfasst Patienten, die zwischen 1998 und 2010 mit einer primären Operation oder Biopsie mit oder ohne adjuvante Strahlentherapie wegen Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle, des Oropharynx und des Hypopharynx behandelt wurden , Kehlkopf und Nasennebenhöhlen.

Die anatomische Lage und das Ausmaß des Primärtumors werden dokumentiert. Die TNM-Klassifizierung basiert auf dem vom American Joint Committee on Cancer (AJCC) überarbeiteten Stadiensystem. Die Patienten werden aus sieben nationalen Krebskrankenhäusern rekrutiert, darunter dem Soroka Medical Center im Negev (Beer Sheva), dem Sourasky Medical Center (Tel Aviv), dem Rabin Medical Center (Petach Tikva), dem Hadassa Medical (Jerusalem) und dem Rambam Medical Center (Haifa). ), Sheba Medical Center (Ramat-Gan) und French Hospital Nazareth (Nazareth). Diese Zentren versorgen fast die gesamte Bevölkerung Israels, einschließlich israelischer Juden, Beduinen, Drusen und israelisch-arabischer Bevölkerung.

Dateneingabe Daten werden in eine im Handel erhältliche Tabellenkalkulation (Microsoft Excel 2000, Microsoft Corporation, Seattle, WA) eingegeben und die statistische Analyse wird mithilfe eines computergestützten Softwarepakets (SPSS) durchgeführt. Wir haben zuvor ein ähnliches System verwendet, um die Ergebnisse von 146 Patienten mit Schädelbasissarkomen in einer internationalen multizentrischen Studie mit 17 Krebszentren zu berichten (17).

Tumorproben Die Proben werden nachträglich gesammelt und bestehen aus Paraffinschnitten von Primärtumoren oder Biopsien, die aus den Archiven der Pathologieabteilung jedes Zentrums stammen. Der Transport von Paraffinblöcken nach Tel Aviv zur Entparaphinisierung und zum HPV-Test erfolgt persönlich durch die Ermittler. Histopathologische Analyse Primärtumorproben werden zunächst von Pathologen bei jedem teilnehmenden Krebs untersucht. Alle Proben werden dann vom Kopf-Hals-Pathologen Dr. Kaplan Ilana erneut analysiert und bewertet. Die Präparation und Gewebeentnahme des Primärtumors erfolgt gemäß den aktuellen Richtlinien für die histopathologische Beurteilung von Kopf-Hals-Karzinomen.

HPV-Nachweis im Labor Gewebeschnitte werden einer Entparaffinierung, einer hitzeinduzierten Zielgewinnung und einem Verdau mit Proteinase K (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) unterzogen, wie zuvor beschrieben (18). Anschließend wird die DNA durch Entparaffinierung, Proteinase-K-Verdauung, Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung von Paraffin gereinigt. Wir werden das HPV-Genotypisierungssystem unter Verwendung eines PCR-basierten HPV-GenoArray-Testkits zur Genotypisierung von 37 HPV-Typen (Hybribio Limited, Hongkong) verwenden. Die Proben werden in PreservCytR LBC-Medium (ThinPrep Liquid Pap Vial; Cytyc Corporation) gegeben. Das Amplicor HPV-Testkit enthält einen Pool HPV-spezifischer Primer zur Amplifikation von HPV-DNA aus 13 HR-Genotypen (Typen 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 und 68). ). Laut Herstellerangabe erkennt der Amplicor HPV-Test die HPV-Genotypen 31, 52, 58 und 59 bei 240 Kopien/ml und die HPV-Genotypen 16, 18, 33, 35, 39, 45, 51, 56 und 68 bei 100 Kopien /ml mit einer Positivitätsrate von mehr als 95 %. Alle Genotypen werden mit einer 100-prozentigen Positivitätsrate bei 480 Kopien/ml nachgewiesen.

HPV-Genotypisierung Die HPV-Genotypisierung wird mithilfe eines kommerziell erhältlichen PCR-basierten HPV-GenoArray-Testkits (Hybribio Limited, Hongkong) durchgeführt, das sowohl DNA-Amplifikation als auch die proprietäre Flow-Through-Hybridisierungstechnik von HybriBio nutzt, um gleichzeitig 21 HPV-Genotypen zu identifizieren, darunter 5 risikoarme Typen (Typen 6, 11, 42, 43 und 44), 14 HR-Typen (Typen 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 und 68), und 2 Typen mit mittlerem Risiko (Typen CP8304 und 53).

Der Test verwendet ein Makroarray-Format mit einer Nylonmembran, auf der HPV-Genotyp-spezifische Oligonukleotidsonden immobilisiert wurden. Zur Validierung der Ergebnisse wird ein In-Situ-Hybridisierungssystem mit dem Amplicor HPV-Test (Roche Molecular Systems) durchgeführt. Dieses Kit ist für den Nachweis und die Unterscheidung von DNA des humanen Papillomavirus (HPV) in paraffineingebettetem Gewebe konzipiert. Als Positivkontrolle wird eine HPV16-positive Tumorprobe verwendet.

S. 16 Immunhistochemie

Der Expressionsstatus von p16 korreliert stark mit dem Tumor-HPV-Status (19) und daher werden wir das Vorhandensein dieses Proteins durch Immunhistochemie bewerten (20). Nachdem 5-μm-Schnitte entparaffiniert wurden, erfolgt die Antigengewinnung mittels hitzeinduzierter Epitopgewinnung mit 10 mM Citratpuffer. Die Immunfärbung wird mit einem automatischen Ventana-Färbegerät (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Zervikale Proben, von denen bekannt ist, dass sie positiv auf HPV sind, werden als Positivkontrolle und normales Gewebe als Basiskontrollen verwendet. Es wird ein monoklonaler Maus-Antikörper gegen p16 (MTM Laboratories, Heidelberg, Deutschland) in einer Verdünnung von 1:500 verwendet. Der p16-Antikörper wird mit der Avidin-Biotin-Peroxidase-Technik (Dako LSAB Kit, Dako) nachgewiesen. Bei der histopathologischen Untersuchung ist das Muster der p16-Expression je nach Tumorprobe im Allgemeinen dichotom, wobei die p16-Färbung entweder fehlt (negativ) oder mit starker und diffuser Kern- und Zytoplasmafärbung vorhanden ist (positiv). Die relative Proteinexpression wird mithilfe einer speziellen Software (Metamorph, Molecular Devices, Union City, CA) geschätzt, die die Intensität und den Bereich der positiven Färbung analysiert. Die immunhistochemische Interpretation wird von zwei Forschern durchgeführt, die keinen Einblick in den HPV-Status und die Identität des Patienten haben, von dem der Tumor stammt.

Bewertung des Zusammenhangs zwischen HPV-Status und therapeutischem Ansprechen oder Überleben bei Patienten mit oropharyngealem/laryngealem Plattenepithelkarzinom. Prospektive Analysen von Fallserien in den Vereinigten Staaten und Europa haben durchweg gezeigt, dass Patienten mit oropharyngealem Plattenepithelkarzinom, die HPV-positiv sind, eine bessere Prognose haben als Patienten mit Tumoren sind HPV-negativ (21,22). Wir werden die Auswirkung des Tumor-HPV-Status auf das Ansprechen auf die Behandlung und die Überlebensergebnisse bei Patienten mit oropharyngealem und laryngealem SCC bewerten, die mit primärer Radiochemotherapie oder Strahlentherapie (Organerhaltungsregime) behandelt wurden.

Datenerfassung Jedes Zentrum sammelt Daten aus Patientenakten. Zu den Daten gehören: Alter, Geschlecht, ethnische Gruppe, Geburts- und Wohnort, Religion, Bildung (jemals Schulbesuch, Anzahl der Schulbesuchsjahre und Alter beim Schulabgang), längster Beruf, Tabakkonsum in seinen verschiedenen Formen Alkoholkonsumgewohnheiten, Ernährungsgewohnheiten, Familienstand, sexuelle Vorgeschichte (Anzahl der lebenslangen Sexualpartner, Besuche bei Prostituierten und Häufigkeit von Oralsex), Vorgeschichte verschiedener Krankheiten, Familiengeschichte von Krebserkrankungen und Gesundheit der Mundhöhle. Ein „Raucher“ ist eine Person, die angibt, mindestens ein Jahr lang täglich Tabak geraucht zu haben. Raucher werden nach der Dauer des Rauchens sowie der Menge und Art des gerauchten Tabaks (Zigaretten, Zigarren, Pfeifen oder jede Form von Kautabak) befragt. . Als „Trinker“ gilt eine Person, die angibt, mindestens einmal im Monat alkoholische Getränke zu trinken. Es werden Einzelheiten zu Getränkearten, Mengen und Dauer des gewohnheitsmäßigen Trinkens eingeholt. Informationen zur Klassifizierung und Stadieneinteilung von Tumorknotenmetastasen werden von den Studienpatienten eingeholt. Diese Klassifizierung wird gemäß dem Cancer Staging Manual des American Joint Committee on Cancer (AJCC) in ein Stadium umgewandelt. Wir bewerten das Ergebnis jeder Therapie im Hinblick auf das Ansprechen (vollständiges Ansprechen, teilweises Ansprechen und fortschreitende Erkrankung gemäß der RECIST-Klassifikation).

Statistische Analyse Fünf-Jahres-Gesamtüberleben (OS), krankheitsspezifisches Überleben (DSS) und lokoregionale Kontrollraten werden mit der Kaplan-Meier-Methode berechnet und der Unterschied in der Überlebensrate wird durch einen Log-Rank-Test bewertet (17). Das OS wird vom Datum der Operation bis zum Todesdatum oder der letzten Nachuntersuchung gemessen. Bei DSS werden Patienten, die aus anderen Gründen als SCC gestorben sind, zum Zeitpunkt ihres Todes zensiert. Die Variablen, die ein prognostisches Potenzial haben und durch eine univariate Analyse vorgeschlagen werden, werden einer multivariaten Analyse mit dem Cox-Proportional-Hazards-Regressionsmodell unterzogen. Alle Statistiken sind zweiseitig. Ein Wert von P < 0,05 wird als Hinweis auf statistische Signifikanz angesehen. Der Vergleich der HPV/p16-Klassifizierung (Drei-Klassen-Modell) erfolgt mittels Kruskal-Wallis-Analyse, gefolgt von einem Wilcoxon-Rangsummentest mit Bonferroni-Korrekturen. Der Vergleich der Proteinexpression anhand der HPV/p16-Klassifizierung erfolgt mithilfe einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) mit Post-hoc-Vergleichen mithilfe des Dunnett-T3-Tests. Der Vergleich des HPV-Klassifizierungsstatus des Drei-Klassen-Modells mit spezifischen klinischen und pathologischen Variablen (Geschlecht, TNM-Stadium, T-Stadium, N-Stadium, histologischer Grad, Management, Strahlentherapie, Radiochemotherapie, Alkoholkonsum, Tabakkonsum und klinisches Ansprechen) wird durchgeführt von Fishers genauer Test. Das klinische Ansprechen wird als vollständiges Ansprechen im Vergleich zu keinem/teilweisem Ansprechen nach Abschluss der Behandlung aufgezeichnet. Alle Berechnungen und Analysen werden mit dem Statistical Package for the Social Sciences Version 11.5 für Windows (SPSS Inc, Chicago, IL) von einem qualifizierten Statistiker am Tel Aviv Souraky Medical Center (Esther Shabtai PhD) durchgeführt.

Stichprobengröße und ihre Begründung Die Prävalenz von HNSCC in Israel wird auf 52 Oropharynx- und 250 Kehlkopfkrebs-Neuerkrankungen pro Jahr geschätzt (Middle East Cancer Consorcium, www.mecc.cancer.gov). Die an dieser Studie teilnehmenden medizinischen Zentren decken 80 % der Bevölkerung des Staates Israel ab. Wir schätzen, dass die Teilnahmequote unter den Fallpatienten 89 % (Bereich von 76 bis 99,0 %) betragen wird (REF JNCI International). Daher wird geschätzt, dass in einem Studienzeitraum von 6 Monaten etwa 100 Proben rekrutiert werden.