头颈部鳞状细胞癌中的人乳头瘤病毒 (HPV) (HPV)

确定以色列与头颈癌相关的高危人乳头瘤病毒类型的患病率和分类。 我们将确定以色列的 HPV 基因型分布，以研究该地区的种族独特性。 许多研究表明 HPV 16 是 HNSCC (NEJM) 中最普遍的类型。 在以色列犹太女性中，HPV 16、39、52 和 18 型是发现的最普遍的基因型 (15)。 在我们的目标中，我们将确定 HNSCC 标本中各种 HPV 基因型的流行率。研究人群该组将包括在 1998 年至 2010 年期间接受过初次手术或活检、有或没有辅助放疗的口腔、口咽、下咽 SCC 患者, 喉和鼻旁窦。

将记录原发肿瘤的解剖部位和范围。 TNM 分类将基于美国癌症联合委员会 (AJCC) 修订的分期系统。 患者将从七家国家癌症转诊医院招募，包括内盖夫（贝尔谢巴）的 Soroka 医疗中心、特拉维夫的 Sourasky 医疗中心、佩塔提克瓦的拉宾医疗中心、耶路撒冷的哈达萨医疗中心、海法的拉姆班医疗中心）、示巴医疗中心（Ramat-Gan）和拿撒勒法国医院（Nazareth）。 这些中心几乎覆盖了以色列的全部人口，包括以色列犹太人、贝都因人、德鲁兹人和以色列阿拉伯人。

数据输入数据将被输入到商业电子表格（Microsoft Excel 2000，Microsoft Corporation，Seattle，WA）中，统计分析将使用计算机化软件包（SPSS）进行。 我们之前曾使用类似的系统在一项包括 17 个癌症中心的国际多中心研究中报告了 146 名颅底肉瘤患者的结果 (17)。

肿瘤标本 标本将被回顾性收集，包括原发性肿瘤的石蜡切片或从每个中心的病理科档案中提取的活检组织。 将石蜡块运送到特拉维夫进行脱石蜡和 HPV 检测将由研究人员亲自进行。 组织病理学分析 原发肿瘤标本将首先由病理学家对每个参与的癌症进行评估。 所有标本都将由头颈病理学家 Kaplan Ilana 博士重新分析和评估。 原发肿瘤的标本解剖和组织取样将根据头颈癌组织病理学评估的现行指南进行。

在实验室进行 HPV 检测 组织切片将进行脱蜡、热诱导目标修复和蛋白酶 K 消化（Roche Diagnostics, Indianapolis, IN），如前所述 (18)。 然后通过脱蜡、蛋白酶 K 消化、苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀从石蜡中纯化 DNA。 我们将使用基于 PCR 的 HPV GenoArray 检测试剂盒的 HPV 基因分型系统对 37 个 HPV 分型（Hybribio Limited，香港）进行基因分型。 将样本置于 PreservCytR LBC 培养基（ThinPrep 液体巴氏小瓶；Cytyc Corporation）中。 Amplicor HPV 检测试剂盒包含一组 HPV 特异性引物，旨在从 13 种 HR 基因型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59 和 68 型）中扩增 HPV DNA ). 根据制造商的说明，Amplicor HPV 测试可检测 240 拷贝/毫升的 HPV 基因型 31、52、58 和 59 以及 100 拷贝的 HPV 基因型 16、18、33、35、39、45、51、56 和 68 /ml 阳性率大于95%。 所有基因型均以 480 拷贝/ml 的 100% 阳性率检测到。

HPV 基因分型 HPV 基因分型是通过使用市售的基于 PCR 的 HPV GenoArray 检测试剂盒（Hybribio Limited，香港）进行的，该试剂盒利用 DNA 扩增和 HybriBio 专有的流穿杂交技术同时鉴定 21 种 HPV 基因型，包括 5 种低风险类型（6、11、42、43 和 44），14 种 HR 类型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66 和 68），和 2 个中等风险类型（CP8304 和 53 型）。

该测试采用带有尼龙膜的宏阵列格式，HPV 基因型特异性寡核苷酸探针已固定在尼龙膜上。 原位杂交系统将与 Amplicor HPV 测试（Roche Molecular Systems）一起执行，以验证结果。 该试剂盒设计用于检测和区分石蜡包埋组织中的人乳头瘤病毒 (HPV) DNA。 HPV16 阳性肿瘤标本将用作阳性对照。

p16 免疫组织化学

p16 的表达状态与肿瘤 HPV 状态密切相关 (19)，因此我们将通过免疫组织化学评估该蛋白的存在 (20)。 在 5- μ m 切片脱石蜡后，通过使用 10 mM 柠檬酸盐缓冲液进行热诱导表位修复来进行抗原修复。 将根据制造商的建议用 Ventana 自动染色机（Ventana Medical Systems, Tucson, AZ）进行免疫染色。 已知对 HPV 呈阳性的宫颈标本将用作阳性对照，正常组织用作基线对照。 将使用 1:500 稀释的针对 p16 的小鼠单克隆抗体（MTM 实验室，德国海德堡）。 使用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶技术（Dako LSAB 试剂盒，Dako）检测 p16 抗体。 在组织病理学检查中，根据肿瘤样本，p16 表达的模式通常是二分法的，p16 染色不存在（阴性）或存在强而弥散的细胞核和细胞质染色（阳性）。 将使用专用软件（Metamorph，Molecular Devices，Union City，CA）估计相对蛋白质表达，该软件分析阳性染色的强度和面积。 免疫组织化学解释将由两名不知道 HPV 状态和肿瘤起源患者身份的研究人员进行。

评估 HPV 状态与口咽/喉 SCC 患者的治疗反应或生存之间的关联 美国和欧洲病例系列的前瞻性分析一致表明，HPV 阳性的口咽 SCC 患者的预后优于肿瘤患者HPV 阴性 (21,22)。 我们将评估肿瘤 HPV 状态对接受主要化放疗或放射治疗（器官保存方案）的口咽和喉 SCC 患者的治疗反应和生存结果的影响。

数据收集 每个中心将从患者图表中收集数据。 数据将包括：年龄、性别、民族、出生和居住地区、宗教、教育（曾经上学、上学年数和离开学校的年龄）、最长职业、不同时期的烟草使用情况形式、饮酒习惯、饮食习惯、婚姻状况、性史（终生性伴侣的数量、嫖妓和口交频率）、各种疾病史、癌症家族史和口腔健康。 “吸烟者”被定义为报告每天吸食烟草至少 1 年的个人，吸烟者将被询问吸烟持续时间以及吸食烟草的数量和类型（香烟、雪茄、烟斗或任何形式的烟草咀嚼） . “饮酒者”被定义为报告每月至少饮用一次酒精饮料的个人。 将获得有关饮料类型、数量和习惯性饮用持续时间的详细信息。 将从研究患者那里获得关于肿瘤-淋巴结-转移分类和分期的信息。 该分类将根据美国癌症联合委员会 (AJCC) 癌症分期手册转换为分期。 我们将根据反应（根据 RECIST 分类的完全反应、部分反应和进展性疾病）评估每种疗法的结果

统计分析 五年总生存率 (OS)、疾病特异性生存率 (DSS) 和局部区域控制率将使用 Kaplan-Meier 方法计算，生存率的差异将通过对数秩检验 (17) 进行评估。 OS 将从手术日期到死亡或最后一次随访日期计算。 对于 DSS，死于 SCC 以外原因的患者将在死亡时被删失。 单变量分析表明具有预后潜力的变量将使用 Cox 比例风险回归模型进行多变量分析。 所有统计数据都是双向的。 P < 0.05 的值将被视为指示统计显着性。 HPV/p16 分类（三类模型）的比较将通过 Kruskal-Wallis 分析进行，然后进行 Wilcoxon 秩和检验和 Bonferroni 校正。 通过 HPV/p16 分类比较蛋白质表达将使用单向方差分析 (ANOVA) 和通过 Dunnett's T3 检验的事后比较进行。 HPV - 三类模型分类状态与特定临床和病理变量（性别、TNM 分期、T 分期、N 分期、组织学分级、管理、放疗、放化疗、饮酒、吸烟和临床反应）的比较，将由Fisher 精确检验。 临床反应将记录为完全反应与治疗完成后无反应/部分反应。 所有计算和分析都将由特拉维夫 Souraky 医学中心（Esther Shabtai 博士）的合格统计学家使用适用于 Windows 的社会科学统计软件包 11.5 版（SPSS Inc，芝加哥，伊利诺伊州）进行。

样本量及其理由 据估计，以色列 HNSCC 的患病率每年有 52 例口咽癌和 250 例喉癌新病例（中东癌症联合会，www.mecc.cancer.gov）。 将参与这项研究的医疗中心覆盖了以色列国 80% 的人口。 我们估计病例患者的参与率为 89%（范围从 76% 到 99.0%）(REF JNCI International)。 因此，估计将招募约 100 个样本的 6 个月研究期。