두경부의 편평 세포 암종에서의 인간 유두종 바이러스(HPV) (HPV)

유병률을 결정하고 이스라엘에서 두경부암과 관련된 고위험 인간 유두종 바이러스 유형을 분류합니다. 우리는 지역의 민족적 고유성을 연구하기 위해 이스라엘의 HPV 유전자형 분포를 결정할 것입니다. 많은 연구에서 HPV 16이 HNSCC(NEJM)에서 가장 널리 퍼진 유형인 것으로 나타났습니다. 이스라엘 유대인 여성에서 HPV 유형 16, 39, 52 및 18이 발견된 가장 일반적인 유전자형이었습니다(15). 우리의 목표에서 우리는 HNSCC 표본에서 다양한 HPV 유전자형의 유병률을 결정할 것입니다. 연구 인구 그룹에는 구강, 구인두, 하인두의 SCC에 대해 1998년에서 2010년 사이에 보조 방사선 요법을 사용하거나 사용하지 않고 1차 수술 또는 생검으로 치료받은 환자가 포함됩니다. , 후두 및 부비동.

원발성 종양의 해부학적 부위와 범위가 기록됩니다. TNM 분류는 AJCC(American Joint Committee on Cancer)에서 개정한 병기 결정 시스템을 기반으로 합니다. 네게브 소로카 메디컬센터(브엘셰바), 소라스키 메디컬센터(텔아비브), 라빈 메디컬센터(페타치티크바), 하다사 메디컬(예루살렘), 람밤 메디컬센터(하이파) 등 7개 국립암진료병원에서 환자를 모집한다. ), Sheba 의료 센터(Ramat-Gan) 및 French Hospital Nazareth(Nazareth). 이 센터는 이스라엘 유대인, 베두인족, 드루즈족 및 이스라엘계 아랍인을 포함하여 이스라엘의 거의 모든 인구를 대상으로 합니다.

데이터 입력 데이터는 상업적으로 이용 가능한 스프레드시트(Microsoft Excel 2000, Microsoft Corporation, Seattle, WA)에 입력되고 통계 분석은 컴퓨터화된 소프트웨어 패키지(SPSS)를 사용하여 수행됩니다. 우리는 이전에 유사한 시스템을 사용하여 17개 암 센터를 포함한 국제 다기관 연구에서 두개골 기저부 육종 환자 146명의 결과를 보고했습니다(17).

종양 표본 표본은 소급적으로 수집되며, 원발성 종양의 파라핀 절편 또는 각 센터의 병리과 기록 보관소에서 가져온 생검으로 구성됩니다. 파라핀 제거 및 HPV 테스트를 위해 파라핀 블록을 텔아비브로 운송하는 것은 조사관이 개인적으로 수행합니다. 조직병리학적 분석 원발성 종양 표본은 각 참여 암에서 병리학자에 의해 먼저 평가될 것입니다. 모든 표본은 두경부 병리학자인 Dr. Kaplan Ilana가 재분석하고 평가합니다. 원발성 종양의 표본 해부 및 조직 샘플링은 두경부암 암종의 조직병리학적 평가를 위한 현행 지침에 따를 것입니다.

실험실에서의 HPV 검출 조직 절편은 이전에 설명한 바와 같이 탈파라핀화, 열유도 표적 검색 및 단백분해효소 K(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)로 분해됩니다(18). 그런 다음 DNA는 탈파라핀화, 프로테이나제 K 소화, 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 파라핀으로부터 정제됩니다. 우리는 37 HPV taypes(Hybribio Limited, Hong Kong)의 유전자형 분석을 위해 PCR 기반 HPV GenoArray 테스트 키트를 사용하는 HPV 유전자형 분석 시스템을 사용할 것입니다. 표본을 PreservCytR LBC 배지(ThinPrep liquid Pap vial; Cytyc Corporation)에 넣습니다. Amplicor HPV 테스트 키트에는 13가지 HR 유전자형(유형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 및 68)에서 HPV DNA를 증폭하도록 설계된 HPV 특정 프라이머 풀이 포함되어 있습니다. ). 제조업체의 사양에 따르면 Amplicor HPV 테스트는 240 copies/ml에서 HPV 유전자형 31, 52, 58 및 59를 검출하고 100 copies에서 HPV 유전자형 16, 18, 33, 35, 39, 45, 51, 56 및 68을 검출합니다. 95% 이상의 양성률을 갖는 /ml. 모든 유전자형은 480 copies/ml에서 100% 양성률로 검출됩니다.

HPV 유전형 분석 HPV 유전형 분석은 상업적으로 이용 가능한 PCR 기반 HPV GenoArray 테스트 키트(Hybribio Limited, Hong Kong)를 사용하여 수행합니다. 이 테스트 키트는 DNA 증폭과 HybriBio의 독점적인 플로우스루 혼성화 기술을 모두 사용하여 5개의 저위험군을 포함하여 21개의 HPV 유전자형을 동시에 식별합니다. 6종, 11종, 42종, 43종, 44종) 인사종목 14종(16종, 18종, 31종, 33종, 35종, 39종, 45종, 51종, 52종, 56종, 58종, 59종, 66종, 68종), 및 2개의 중간 위험 유형(유형 CP8304 및 53).

테스트는 HPV 유전자형 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정된 나일론 멤브레인이 있는 매크로어레이 형식을 사용합니다. In Situ Hybridization 시스템은 결과 검증을 위해 Amplicor HPV 테스트(Roche Molecular Systems)와 함께 수행됩니다. 이 키트는 파라핀 포매 조직에서 HPV(Human Papilloma Virus) DNA를 검출하고 식별하도록 설계되었습니다. HPV16 양성 종양 표본을 양성 대조군으로 사용합니다.

p16 면역조직화학

p16의 발현 상태는 종양 HPV 상태와 강한 상관관계가 있으므로(19) 면역조직화학으로 이 단백질의 존재를 평가할 것입니다(20). 5μm 절편을 탈파라핀 처리한 후 10mM 구연산 완충액을 사용하여 열 유도 에피토프 검색을 사용하여 항원 검색을 수행합니다. 제조업체의 권장 사항에 따라 Ventana 자동 염색기(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ)를 사용하여 면역염색을 수행할 것입니다. HPV 양성인 것으로 알려진 자궁 경부 표본은 양성 대조군으로, 정상 조직은 기준선 대조군으로 사용됩니다. 1:500 희석에서 p16(MTM Laboratories, Heidelberg, Germany)에 대한 마우스 단클론 항체가 이용될 것이다. p16 항체는 avidin-biotin-peroxidase 기술(Dako LSAB Kit, Dako)을 사용하여 검출됩니다. 조직병리학적 검토에서, p16 발현 패턴은 일반적으로 종양 샘플에 따라 이분법적이며, p16 염색은 부재(음성) 또는 강하고 확산된 핵 및 세포질 염색(양성)으로 존재합니다. 양성 염색의 강도와 면적을 분석한 전용 소프트웨어(Metamorph, Molecular Devices, Union City, CA)를 사용하여 상대 단백질 발현을 추정할 것입니다. 면역조직화학적 해석은 HPV 상태와 종양이 발생한 환자의 신원을 알지 못하는 두 명의 조사관에 의해 수행될 것입니다.

구인두/후두 SCC 환자의 HPV 상태와 치료 반응 또는 생존 간의 연관성 평가 미국과 유럽의 사례 시리즈에 대한 전향적 분석은 HPV 양성인 구인두 SCC 환자가 종양 환자보다 더 나은 예후를 갖는다는 것을 지속적으로 입증했습니다. HPV 음성입니다(21,22). 우리는 1차 화학방사선 요법 또는 방사선 요법(장기 보존 요법)으로 치료받은 구인두 및 후두 SCC 환자의 치료 반응 및 생존 결과에 대한 종양 HPV 상태의 영향을 평가할 것입니다.

데이터 수집 각 센터는 환자 차트에서 데이터를 수집합니다. 데이터에는 연령, 성별, 인종 그룹, 출생 및 거주 지역, 종교, 교육(출석 경험, 학교 출석 연수, 학교를 그만둔 나이), 가장 긴 직업, 다양한 방식의 담배 사용이 포함됩니다. 형태, 음주습관, 식습관, 결혼여부, 성생활력(평생 성관계 상대수, 매춘부 방문횟수, 구강성교 횟수), 각종 질병력, 암 가족력, 구강건강 등 "흡연자"는 최소 1년 동안 매일 담배를 피웠다고 보고한 개인으로 정의되며, 흡연자는 흡연 기간, 흡연량 및 유형(궐련, 시가, 파이프 또는 모든 형태의 담배 씹기)에 대해 질문을 받습니다. . "음주자"는 적어도 한 달에 한 번 이상 알코올성 음료를 마신다고 보고하는 개인으로 정의됩니다. 음료의 종류, 양 및 습관적 음주 기간에 대한 세부 정보를 얻을 수 있습니다. 종양-결절-전이 분류 및 병기에 대한 정보는 연구 환자로부터 얻을 것입니다. 이 분류는 AJCC(American Joint Committee on Cancer) 암 병기 결정 매뉴얼에 따라 단계로 변환됩니다. 각 요법의 반응(RECIST 분류에 따른 완전 반응, 부분 반응 및 진행성 질환) 측면에서 결과를 평가합니다.

통계 분석 Kaplan-Meier 방법을 사용하여 5년 전체 생존(OS), 질병 특이적 생존(DSS) 및 국소 제어율을 계산하고 생존율의 차이를 로그 순위 테스트(17)로 평가합니다. OS는 수술 날짜부터 사망 날짜 또는 마지막 추적 날짜까지 측정됩니다. DSS의 경우 SCC 이외의 원인으로 사망한 환자는 사망 시 검열됩니다. 단변량 분석에 의해 제안된 예후 가능성을 가질 변수는 Cox 비례 위험 회귀 모델을 사용하여 다변량 분석을 받게 됩니다. 모든 통계는 양면성이 있습니다. P< 0.05의 값은 통계적 유의성을 나타내는 것으로 간주됩니다. HPV/p16 분류(3등급 모델)의 비교는 Kruskal-Wallis 분석에 이어 Bonferroni 보정을 사용한 Wilcoxon 순위 합계 테스트에 의해 수행됩니다. HPV/p16 분류에 의한 단백질 발현의 비교는 Dunnett의 T3 테스트에 의한 사후 비교와 함께 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 이루어질 것이다. HPV의 비교 - 특정 임상 및 병리학적 변수(성별, TNM 병기, T 병기, N 병기, 조직학적 등급, 관리, 방사선 요법, 화학방사선 요법, 알코올 사용, 담배 사용 및 임상 반응)를 사용한 세 가지 클래스 모델 분류 상태는 다음에 의해 수행됩니다. 피셔의 정확 검정. 임상 반응은 치료 완료 후 완전 반응 대 무반응/부분 반응으로 기록됩니다. 모든 계산 및 분석은 Tel Aviv Souraky Medical Center(Esther Shabtai PhD)의 자격을 갖춘 통계학자가 Windows용 사회 과학 버전 11.5용 통계 패키지(SPSS Inc, Chicago, IL)를 사용하여 수행합니다.

샘플 크기 및 타당성 이스라엘에서 HNSCC의 유병률은 연간 52건의 구강인두암 및 250건의 후두암으로 추정됩니다(Middle East cancer consorcium, www.mecc.cancer.gov). 이 연구에 참여할 의료 센터는 이스라엘 인구의 80%를 커버합니다. 사례 환자의 참여율은 89%(76~99.0% 범위)로 추정됩니다(REF JNCI International). 따라서 6개월의 연구 기간으로 약 100개의 샘플이 모집될 것으로 예상됩니다.