Papilomavírus Humano (HPV) em Carcinoma Espinocelular de Cabeça e Pescoço (HPV)

Determinar a prevalência e classificar os tipos de papilomavírus humano de alto risco associados ao câncer de cabeça e pescoço em Israel. Determinaremos a distribuição do genótipo do HPV em Israel para estudar a singularidade étnica da região. Muitos estudos mostraram que o HPV 16 é o tipo mais prevalente em HNSCC (NEJM). Em mulheres judias israelenses, os tipos de HPV 16, 39, 52 e 18 foram os genótipos mais prevalentes encontrados (15). Em nosso objetivo, determinaremos a prevalência de vários genótipos de HPV em espécimes de HNSCC. População do estudo O grupo incluirá pacientes tratados com cirurgia primária ou biópsia, com ou sem radioterapia adjuvante entre 1998 e 2010 para SCC da cavidade oral, orofaringe, hipofaringe , laringe e seios paranasais.

O local anatômico e a extensão do tumor primário serão documentados. A classificação TNM será baseada no sistema de estadiamento revisado pelo American Joint Committee on Cancer (AJCC). Os pacientes serão recrutados em sete hospitais nacionais de referência para câncer, incluindo Soroka Medical Center em Negev (Beer Sheva), Sourasky Medical Center (Tel Aviv), Rabin Medical Center (Petach Tikva), Hadassa Medical (Jerusalém), Rambam Medical Center (Haifa ), Sheba Medical Center (Ramat-Gan) e French Hospital Nazareth (Nazareth). Esses centros cobrem quase toda a população de Israel, incluindo judeus israelenses, beduínos, drusos e população árabe israelense.

Entrada de dados Os dados serão inseridos em uma planilha disponível comercialmente (Microsoft Excel 2000, Microsoft Corporation, Seattle, WA) e a análise estatística será realizada usando um pacote de software computadorizado (SPSS). Anteriormente, usamos um sistema semelhante para relatar os resultados de 146 pacientes com sarcomas da base do crânio em um estudo multicêntrico internacional, incluindo 17 centros de câncer (17).

Espécimes tumorais Os espécimes serão coletados retrospectivamente e consistirão em seções de parafina de tumores primários ou biópsias recuperadas dos arquivos do departamento de patologia de cada centro. O transporte dos blocos de parafina para Tel Aviv para desparafinação e teste de HPV será feito pessoalmente pelos investigadores. Análise histopatológica Espécimes de tumores primários serão primeiro avaliados por patologistas em cada câncer participante. Todos os espécimes serão então reanalisados ​​e avaliados pelo patologista de cabeça e pescoço, Dr. Kaplan Ilana. A dissecção do espécime e a amostragem de tecido do tumor primário estarão de acordo com as diretrizes atuais para a avaliação histopatológica do carcinoma de câncer de cabeça e pescoço.

Detecção de HPV no laboratório Seções de tecido serão submetidas a desparafinização, recuperação de alvo induzida por calor e digestão com proteinase K (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), conforme descrito anteriormente (18). O DNA é então purificado da parafina por desparafinização, digestão com proteinase K, extração com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol. Usaremos o sistema de genotipagem de HPV usando um kit de teste HPV GenoArray baseado em PCR para genotipagem de 37 tipos de HPV (Hybribio Limited, Hong Kong). As amostras são colocadas em meio PreservCytR LBC (frasco ThinPrep liquid Pap; Cytyc Corporation). O kit de teste Amplicor HPV contém um pool de primers específicos para o HPV projetados para amplificar o DNA do HPV de 13 genótipos HR (tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68 ). De acordo com as especificações do fabricante, o teste Amplicor HPV detecta os genótipos de HPV 31, 52, 58 e 59 a 240 cópias/ml e os genótipos de HPV 16, 18, 33, 35, 39, 45, 51, 56 e 68 a 100 cópias /ml com uma taxa de positividade superior a 95%. Todos os genótipos são detectados com uma taxa de positividade de 100% a 480 cópias/ml.

Genotipagem do HPV A genotipagem do HPV é realizada usando um kit de teste GenoArray do HPV baseado em PCR disponível comercialmente (Hybribio Limited, Hong Kong), que faz uso da amplificação do DNA e da técnica de hibridação de fluxo proprietária da HybriBio para identificar simultaneamente 21 genótipos do HPV, incluindo 5 de baixo risco tipos (tipos 6, 11, 42, 43 e 44), 14 tipos HR (tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68), e 2 tipos de risco intermediário (tipos CP8304 e 53).

O teste emprega um formato macroarray com uma membrana de nylon na qual foram imobilizadas sondas oligonucleotídicas específicas do genótipo do HPV. O sistema de Hibridização In Situ será realizado com o teste Amplicor HPV (Roche Molecular Systems) para validação dos resultados. Este kit foi desenvolvido para a detecção e discriminação do DNA do vírus do papiloma humano (HPV) em tecidos embebidos em parafina. Um espécime de tumor positivo para HPV16 será usado como controle positivo.

p16 Imuno-histoquímica

O status de expressão de p16 está fortemente correlacionado com o status de HPV do tumor (19) e, portanto, avaliaremos a presença dessa proteína por imuno-histoquímica (20). Depois que as seções de 5 μm são desparafinizadas, a recuperação do antígeno é realizada pelo uso de recuperação de epítopos induzida por calor com tampão citrato 10 mM. A imunocoloração será realizada com um corante automático Ventana (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) de acordo com as recomendações do fabricante. Espécimes cervicais positivos para HPV serão usados ​​como controle positivo e tecidos normais como controles basais. Será utilizado anticorpo monoclonal de camundongo contra p16 (MTM Laboratories, Heidelberg, Alemanha) na diluição de 1:500. O anticorpo p16 é detectado usando a técnica avidina-biotina-peroxidase (Dako LSAB Kit, Dako). Na revisão histopatológica, o padrão de expressão de p16 é geralmente dicotômico de acordo com a amostra do tumor, com coloração de p16 ausente (negativa) ou presente com forte e difusa coloração nuclear e citoplasmática (positiva). A expressão relativa da proteína será estimada usando software dedicado (Metamorph, Molecular Devices, Union City, CA), que analisou a intensidade e a área de coloração positiva. A interpretação imuno-histoquímica será realizada por dois investigadores que desconheciam o status do HPV e a identidade do paciente de quem o tumor se originou.

Avaliação da associação entre status de HPV e resposta terapêutica ou sobrevida em pacientes com CEC de orofaringe/laringe Análises prospectivas de séries de casos nos Estados Unidos e na Europa demonstraram consistentemente que pacientes com CCE de orofaringe que são HPV-positivos têm um prognóstico melhor do que pacientes cujos tumores são HPV negativos (21,22). Avaliaremos o efeito do status de HPV do tumor na resposta ao tratamento e nos resultados de sobrevida entre pacientes com CEC de orofaringe e laringe tratados com quimiorradiação primária ou radioterapia (regime de preservação de órgãos).

Coleta de dados Cada centro coletará dados dos prontuários dos pacientes. Os dados incluirão: idade, sexo, etnia, local de nascimento e residência, religião, escolaridade (frequência escolar alguma vez, número de anos de frequência escolar e idade de saída da escola), ocupação mais longa, uso de tabaco nas suas diferentes formas, hábitos de consumo de álcool, hábitos alimentares, estado civil, história sexual (número de parceiros sexuais ao longo da vida, visitas a prostitutas e frequência de sexo oral), histórias de várias doenças, história familiar de câncer e saúde da cavidade oral. Um "fumante" é definido como um indivíduo que relata ter fumado tabaco diariamente por pelo menos 1 ano, e os fumantes serão questionados sobre a duração do tabagismo e a quantidade e tipo de tabaco fumado (cigarros, charutos, cachimbos ou qualquer forma de mascar tabaco) . Um "bebedor" é definido como um indivíduo que relata beber bebidas alcoólicas pelo menos uma vez por mês. Detalhes serão obtidos sobre tipos de bebidas, quantidades e duração do consumo habitual. informações sobre classificação e estadiamento tumor-nódulo-metástase serão obtidas dos pacientes do estudo. Essa classificação será convertida em estágio de acordo com o Manual de Estadiamento do Câncer do Comitê Conjunto Americano de Câncer (AJCC). Avaliaremos o resultado de cada terapia em termos de resposta (resposta completa, resposta parcial e doença progressiva de acordo com a classificação RECIST)

Análise estatística A sobrevida global (OS) em cinco anos, a sobrevida específica da doença (DSS) e as taxas de controle locorregional serão calculadas usando o método Kaplan-Meier e a diferença na taxa de sobrevida será avaliada por um teste de log rank (17). A OS será medida a partir da data da cirurgia até a data da morte ou último acompanhamento. Para DSS, os pacientes que faleceram por outras causas que não SCC serão censurados no momento da morte. As variáveis ​​que terão potencial prognóstico sugerido pela análise univariada serão submetidas à análise multivariada com o modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox. Todas as estatísticas serão bilaterais. Um valor de P< 0,05 será considerado para indicar significância estatística. A comparação da classificação HPV/p16 (modelo de três classes) será realizada pela análise de Kruskal-Wallis seguida do teste de Wilcoxon rank sum com correções de Bonferroni. A comparação da expressão da proteína pela classificação do HPV/p16 será feita por análise de variância (ANOVA) de uma via com comparações post hoc pelo teste T3 de Dunnett. A comparação do status de classificação do modelo de três classes de HPV com variáveis ​​clínicas e patológicas específicas (sexo, estágio TNM, estágio T, estágio N, grau histológico, manejo, radioterapia, quimiorradiação, uso de álcool, uso de tabaco e resposta clínica) será realizada por Teste exato de Fisher. A resposta clínica será registrada como resposta completa versus nenhuma resposta/resposta parcial após a conclusão do tratamento. Todos os cálculos e análises serão realizados com o Statistical Package for the Social Sciences versão 11.5 for Windows (SPSS Inc, Chicago, IL), por um estatístico qualificado do Tel Aviv Souraky Medical Center (Esther Shabtai PhD).

Tamanho da amostra e sua justificativa A prevalência de HNSCC em Israel é estimada em 52 novos casos de câncer de orofaringe e 250 de laringe por ano (consórcio de câncer do Oriente Médio, www.mecc.cancer.gov). Os centros médicos que participarão deste estudo cobrem 80% da população do Estado de Israel. estimamos que a taxa de participação entre os casos de pacientes será de 89% (intervalo de 76 a 99,0%) (REF JNCI International). Portanto, estima-se um período de estudo de 6 meses, aproximadamente 100 amostras serão recrutadas.