Humaan papillomavirus (HPV) bij plaveiselcelcarcinoom van het hoofd-halsgebied (HPV)

Het bepalen van de prevalentie en het classificeren van de hoogrisico typen humaan papillomavirus geassocieerd met hoofd-halskanker in Israël. We zullen de verspreiding van het HPV-genotype in Israël bepalen om de etnische uniciteit van de regio te bestuderen. Veel onderzoeken hebben aangetoond dat HPV 16 het meest voorkomende type is bij HNSCC (NEJM). Bij Israëlisch-joodse vrouwen waren de HPV-typen 16, 39, 52 en 18 de meest voorkomende genotypen die werden aangetroffen (15). In ons doel zullen we de prevalentie van verschillende HPV-genotypes in HNSCC-specimens bepalen. Studiepopulatie De groep omvat patiënten behandeld met primaire chirurgie of biopsie, met of zonder adjuvante radiotherapie tussen 1998 en 2010 voor SCC van de mondholte, orofarynx, hypofarynx , strottenhoofd en neusbijholten.

De anatomische plaats en omvang van de primaire tumor zullen worden gedocumenteerd. De TNM-classificatie van zal gebaseerd zijn op het stadiëringssysteem dat is herzien door de American Joint Committee on Cancer (AJCC). Patiënten zullen worden gerekruteerd uit zeven nationale ziekenhuizen die verwijzen naar kanker, waaronder Soroka Medical Center in de Negev (Beer Sheva), Sourasky Medical Center (Tel Aviv), Rabin Medical Center (Petach Tikva), Hadassa Medical (Jeruzalem), Rambam Medical Center (Haifa ), Sheba medisch centrum (Ramat-Gan) en French Hospital Nazareth (Nazareth). Deze centra bestrijken bijna de gehele bevolking van Israël, inclusief Israëlische joden, bedoeïenen, druzen en Israëlisch-Arabische bevolking.

Gegevensinvoer Gegevens worden ingevoerd in een in de handel verkrijgbare spreadsheet (Microsoft Excel 2000, Microsoft Corporation, Seattle, WA) en statistische analyse wordt uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerd softwarepakket (SPSS). We hebben eerder een soortgelijk systeem gebruikt om de resultaten te rapporteren van 146 patiënten met schedelbasissarcomen in een internationale multicenter studie met inbegrip van 17 kankercentra (17).

Tumorspecimens Specimens zullen retrospectief worden verzameld en bestaan ​​uit paraffinecoupes van primaire tumoren of biopsieën die zijn opgehaald uit de archieven van de pathologieafdeling in elk centrum. Het transport van paraffineblokken naar Tel Aviv voor deparaffinisatie en HPV-testen zal persoonlijk door de onderzoekers plaatsvinden. Histopathologische analyse Primaire tumorspecimens zullen eerst worden geëvalueerd door pathologen bij elke deelnemende kanker. Alle monsters worden vervolgens opnieuw geanalyseerd en beoordeeld door hoofd-halspatholoog dr. Kaplan Ilana. Monsterdissectie en weefselbemonstering van de primaire tumor zullen in overeenstemming zijn met de huidige richtlijnen voor de histopathologische beoordeling van hoofd-halskankercarcinoom.

HPV-detectie in het laboratorium. Weefselcoupes zullen worden onderworpen aan deparaffinisatie, door hitte geïnduceerde targetretrieval en digestie met proteïnase K (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), zoals eerder beschreven (18). DNA wordt vervolgens gezuiverd uit paraffine door deparaffinisatie, proteïnase K-digestie, fenol/chloroform-extractie en ethanolprecipitatie. We zullen het HPV-genotyperingssysteem gebruiken met behulp van een PCR-gebaseerde HPV GenoArray-testkit voor genotypering van 37 HPV-taypes (Hybribio Limited, Hong Kong). Specimens worden in PreservCytR LBC-medium (ThinPrep Liquid Pap Vial; Cytyc Corporation) geplaatst. De Amplicor HPV-testkit bevat een verzameling HPV-specifieke primers die zijn ontworpen om HPV-DNA te amplificeren van 13 HR-genotypes (typen 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 en 68 ). Volgens de specificaties van de fabrikant detecteert de Amplicor HPV-test HPV-genotypes 31, 52, 58 en 59 bij 240 kopieën/ml en HPV-genotypes 16, 18, 33, 35, 39, 45, 51, 56 en 68 bij 100 kopieën /ml met een positiviteitspercentage van meer dan 95%. Alle genotypen worden gedetecteerd met een positiviteitspercentage van 100% bij 480 kopieën/ml.

HPV-genotypering HPV-genotypering wordt uitgevoerd met behulp van een in de handel verkrijgbare op PCR gebaseerde HPV GenoArray-testkit (Hybribio Limited, Hong Kong), die gebruikmaakt van zowel DNA-amplificatie als HybriBio's gepatenteerde doorstroomhybridisatietechniek om gelijktijdig 21 HPV-genotypes te identificeren, waaronder 5 laag-risico typen (typen 6, 11, 42, 43 en 44), 14 HR-typen (typen 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 en 68), en 2 typen met gemiddeld risico (types CP8304 en 53).

De test maakt gebruik van een macroarray-formaat met een nylonmembraan waarop HPV-genotypespecifieke oligonucleotideprobes zijn geïmmobiliseerd. In situ hybridisatiesysteem zal worden uitgevoerd met Amplicor HPV-test (Roche Molecular Systems) voor validatie van de resultaten. Deze kit is ontworpen voor de detectie en discriminatie van DNA van het humaan papillomavirus (HPV) in in paraffine ingebed weefsel. Een HPV16-positief tumorspecimen zal als positieve controle worden gebruikt.

p16 Immunohistochemie

De expressiestatus van p16 is sterk gecorreleerd met tumor-HPV-status (19) en daarom zullen we de aanwezigheid van dit eiwit evalueren door middel van immunohistochemie (20). Nadat secties van 5 μm van paraffine zijn ontdaan, wordt antigeenterugwinning uitgevoerd door gebruik te maken van warmte-geïnduceerde epitoopterugwinning met 10 mM citraatbuffer. Immunokleuring zal worden uitgevoerd met een Ventana geautomatiseerde kleurmachine (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Baarmoederhalsmonsters waarvan bekend is dat ze positief zijn voor HPV, zullen worden gebruikt als positieve controle en normale weefsels als basislijncontroles. Een muis monoklonaal antilichaam tegen p16 (MTM Laboratories, Heidelberg, Duitsland) in een verdunning van 1:500 zal worden gebruikt. Het p16-antilichaam wordt gedetecteerd met behulp van de avidine-biotine-peroxidasetechniek (Dako LSAB Kit, Dako). Bij histopathologische beoordeling is het patroon van p16-expressie over het algemeen dichotoom volgens het tumormonster, met p16-kleuring ofwel afwezig (negatief) of aanwezig met sterke en diffuse nucleaire en cytoplasmatische kleuring (positief). De relatieve eiwitexpressie zal worden geschat met behulp van speciale software (Metamorph, Molecular Devices, Union City, CA), die de intensiteit en het gebied van positieve kleuring analyseerde. Immunohistochemische interpretatie zal worden uitgevoerd door twee onderzoekers die blind zijn voor de HPV-status en identiteit van de patiënt van wie de tumor afkomstig is.

Evaluatie van het verband tussen HPV-status en therapeutische respons of overleving bij patiënten met SCC voor orofarynx/larynx Prospectieve analyses van casusreeksen in de Verenigde Staten en Europa hebben consequent aangetoond dat patiënten met SCC voor orofarynx die HPV-positief zijn een betere prognose hebben dan patiënten bij wie de tumoren zijn HPV-negatief (21,22). We zullen het effect van tumor-HPV-status op behandelingsrespons en overlevingsresultaten evalueren bij patiënten met orofaryngeaal en larynx SCC die werden behandeld met primaire chemoradiatie of bestralingstherapie (regime voor orgaanbehoud).

Gegevensverzameling Elk centrum verzamelt gegevens uit patiëntendossiers. De gegevens omvatten: leeftijd, geslacht, etnische groep, geboorteplaats en woonplaats, religie, opleiding (ooit naar school geweest, aantal jaren schoolbezoek en leeftijd bij het verlaten van de school), langste beroep, gebruik van tabak in zijn verschillende vormen, alcoholgebruik, voedingsgewoonten, burgerlijke staat, seksuele geschiedenis (aantal levenslange seksuele partners, bezoeken aan prostituees en frequentie van orale seks), geschiedenis van verschillende ziekten, familiegeschiedenis van kanker en gezondheid van de mondholte. Een "roker" wordt gedefinieerd als een persoon die aangeeft gedurende ten minste 1 jaar dagelijks tabak te hebben gerookt, en rokers zullen worden gevraagd naar de duur van het roken en de hoeveelheid en het type gerookte tabak (sigaretten, sigaren, pijpen of enige vorm van tabaksgebruik). . Een "drinker" wordt gedefinieerd als een persoon die aangeeft minstens één keer per maand alcoholische dranken te drinken. Details zullen worden verkregen over soorten dranken, hoeveelheden en duur van gewoon drinken. informatie over classificatie en stadiëring van tumor-knoop-metastase zal worden verkregen van de studiepatiënten. Deze classificatie zal worden omgezet in stadium volgens de American Joint Committee on Cancer (AJCC) Cancer Staging Manual. We zullen het resultaat van elke therapie evalueren in termen van respons (volledige respons, gedeeltelijke respons en progressieve ziekte volgens de RECIST-classificatie)

Statistische analyse Vijfjaars totale overleving (OS), ziektespecifieke overleving (DSS) en locoregionale controlepercentages zullen worden berekend met behulp van de Kaplan-Meier-methode en het verschil in overlevingspercentage zal worden beoordeeld door middel van een log-ranktest (17). OS wordt gemeten vanaf de datum van de operatie tot de datum van overlijden of de laatste follow-up. Voor DSS worden de patiënten die zijn overleden aan andere oorzaken dan SCC gecensureerd op het moment van overlijden. De variabelen die prognostisch potentieel hebben, gesuggereerd door univariate analyse, zullen worden onderworpen aan multivariate analyse met het Cox-regressiemodel voor proportionele gevaren. Alle statistieken zullen tweezijdig zijn. Een waarde van P < 0,05 wordt beschouwd als statistische significantie. Vergelijking van HPV/p16-classificatie (model met drie klassen) zal worden uitgevoerd door Kruskal-Wallis-analyse gevolgd door Wilcoxon-rangsomtest met Bonferroni-correcties. Vergelijking van eiwitexpressie door HPV/p16-classificatie zal worden gemaakt met behulp van one-way variantieanalyse (ANOVA) met post hoc vergelijkingen door Dunnett's T3-test. Vergelijking van HPV - classificatiestatus in drie klassen met specifieke klinische en pathologische variabelen (geslacht, TNM-stadium, T-stadium, N-stadium, histologische graad, behandeling, radiotherapie, chemoradiatie, alcoholgebruik, tabaksgebruik en klinische respons), zal worden uitgevoerd door Fisher's exact-test. Klinische respons wordt geregistreerd als volledige respons versus geen respons/gedeeltelijke respons na voltooiing van de behandeling. Alle berekeningen en analyses worden uitgevoerd met het Statistical Package for the Social Sciences versie 11.5 voor Windows (SPSS Inc, Chicago, IL), door een gekwalificeerde statisticus van Tel Aviv Souraky Medical Center (Esther Shabtai PhD).

Steekproefomvang en rechtvaardiging De prevalentie van HNSCC in Israël wordt geschat op 52 nieuwe gevallen van orofarynxkanker en 250 nieuwe gevallen van larynxkanker per jaar (Middle East cancer consorcium, www.mecc.cancer.gov). De medische centra die aan dit onderzoek zullen deelnemen, dekken 80% van de bevolking van de staat Israël. we schatten dat de participatiegraad onder casuspatiënten 89% zal zijn (variërend van 76 tot 99,0%) (REF JNCI International). Daarom wordt geschat dat een studieperiode van 6 maanden ongeveer 100 monsters zal worden aangeworven.