SEXI：外傷神経と非外傷神経における坐骨神経の発現と差異タンパク質の同定 (SEXI)

最終的な切断の修正と閉鎖が予定されている被験者は、研究に参加するようアプローチされます。 研究参加者の計画された切断修正の日に、研究スタッフは外科スタッフと連絡を取り、神経標本の回収を調整します。 患者が膝上切断術を受ける場合は坐骨神経標本が採取され、患者が膝下または膝下切断術を受ける場合は脛骨神経標本が採取されます (坐骨神経の主要成分膝窩で脛骨神経と腓骨神経に分かれた後）。 外科医は、標本の近位端に縫合糸を配置して、外傷を受けていない神経の端を示し、サンプリングされた神経の縦方向の位置の推定値を提供します（つまり、 膝関節線の遠位 10cm、膝関節レベルで膝の近位 15cm)。 メスを使用して、各サンプルを同じ方法で切除します。 組織が外科医によって切除されると、被験者の研究識別番号 (2 つのサンプルがその被験者から取得されている場合は接尾辞「A」または「B」) でラベル付けされたプラスチック製の試験管に入れられます。研究スタッフのメンバーに移され、すぐに液体窒素で凍結されました。 凍結された標本は、分析前に-80°Cで保存される研究プログラム部門の研究室に届けられます。 近位、中間、および遠位のサンプルは DRP ラボで取得され、神経の残りのセグメントは、将来の分析のために -80 冷凍庫に置き換えられます。 その後、サンプルはデューク大学に送られ、安全な航空便で処理および分析されます。 サンプルを処理するタスクは、デューク大学の同僚による質量分析分析の直前に実行されます。 共同研究者であるモーズリー博士の研究室の責任には、タンパク質の抽出とアッセイの両方が含まれます。 サンプルあたりの抽出数は、長さによって異なりますが、2 から約 50 までです。 共同研究者である Van de ven 博士の研究室での責任には、サンプルの取り扱い、病理学的検査、組織学的検査のための薄切片の除去、RNA、DNA、およびタンパク質抽出のためのセグメントの均質化が含まれます。

個々のセグメントを氷上で解凍し、解凍後すぐにホモジナイズします。 ホモジナイゼーション法は、最高の溶解タンパク質含有量を生成するように最適化されます。 試行される方法には、超音波処理、ラボ用ブレンダーによる機械的破壊、手動チョッピングに続くポッター デバイスによる機械的破壊、および凍結融解が含まれます。

試行されるバッファーおよび溶媒システムの変数には、塩濃度、pH およびバッファーの種類、カオトロープ濃度 (尿素およびチオ尿素)、DMSO などの有機共溶媒の存在、および非イオン性界面活性剤の存在が含まれます。 すべてのホモジナイゼーションは、プロテアーゼ阻害剤の存在下で、0 ～ 4°C で実行されます。

プロテオミクス分析では、高速液体クロマトグラフィー/エレクトロスプレー質量分析が、健康な組織と外傷を受けた組織のタンパク質発現の違いを発見するための補完的な方法として採用されます。 可溶性および可溶化タンパク質の固相抽出に続いて、UV吸光度および/または総イオン電流によって検出されたタンパク質ピークの分離のための条件を最適化し、抽出されたタンパク質の異なるセットに焦点を当てるために複数の条件セットを採用する場合があります。 高多孔性 C-18 逆相カラムを使用してサイトゾルタンパク質を分離し、C-4 を膜タンパク質に分離します。 Research Operations Service (ROS) の Shimadzu LCMS-IT-TOF 質量分析計と一致するイオン化、フラグメンテーション、および検出の標準的な方法が使用されます。

RNA分析のために、抽出されたRNAは、ゲノムおよび計算生物学のゲノム技術コアのためのデュークセンターに持ち込まれます。 そこでは、Agilent 2100バイオアナライザーとそれに続くAffymetrix GeneChip分析を使用してRNAの品質が決定されます。 Duke Center for Genomic and Computational Biology で働く生物統計学者の David Corcoran がデータ分析を行います。

この研究では、標準治療への変更は実施されません。 そうでなければ、坐骨神経標本は人間の組織として廃棄されます。これらの標本を使用した他の進行中の調査はありません。

坐骨神経の分析に続いて、被験者のチャートからデータ（人口統計、損傷、疼痛治療情報、術前疼痛スコア）を収集して、二次結果変数を決定します。 (付録 B - 症例報告フォームを参照)