SEXI: Expresión ciática e identificación de proteínas diferenciales en nervios traumatizados versus no traumatizados (SEXI)

Los sujetos programados para revisión final de amputación y cierre(s) serán contactados para participar en el estudio. El día de la revisión de la amputación planificada del participante del estudio, el personal de investigación se comunicará con el personal quirúrgico para coordinar la recuperación de la muestra del nervio. Si un paciente va a tener una amputación por encima de la rodilla, se obtendrá una muestra del nervio ciático, si un paciente va a tener una amputación por debajo de la rodilla o a través de la rodilla, se obtendrá una muestra del nervio tibial (el componente principal del nervio ciático después de dividirse en los nervios tibial y peroneo en la fosa poplítea de la rodilla). El cirujano colocará una sutura en el extremo proximal de la muestra para indicar el extremo no traumatizado del nervio, y también proporcionará una estimación de la ubicación longitudinal del nervio muestreado (es decir, 10 cm distal a la línea de la articulación de la rodilla, 15 cm proximal a la rodilla al nivel de la articulación de la rodilla). Cada muestra se extirpará de la misma manera, utilizando un bisturí. Una vez que el cirujano extirpa el tejido, se colocará en un tubo de ensayo de plástico etiquetado con el número de identificación del estudio de los sujetos (con el sufijo "A" o "B" si se extraen dos muestras de ese sujeto), transferido a un miembro del personal de investigación e inmediatamente congelado en nitrógeno líquido. Luego, la muestra congelada se enviará al laboratorio del Departamento de Programas de Investigación, donde se almacenará a -80 °C antes del análisis. Las muestras promixal, media y distal se obtendrán en el laboratorio de DRP y los segmentos de nervio restantes se reemplazarán en el congelador -80 para futuros análisis. Luego, las muestras se enviarán a la Universidad de Duke para su procesamiento y análisis a través de un servicio de correo aéreo seguro. La tarea de procesar las muestras se realizará inmediatamente antes del análisis de espectroscopia de masas por parte de colegas de la Universidad de Duke. Las responsabilidades de laboratorio del colaborador Dr. Moseley incluyen tanto la extracción como el ensayo de proteínas. El número de extracciones por muestra variará en función de su longitud, desde 2 hasta unas 50. Las responsabilidades de laboratorio del colaborador Dr. Van de ven incluyen la manipulación de muestras, el examen patológico, la eliminación de cortes finos para el examen histológico y la homogeneización de segmentos para la extracción de ARN, ADN y proteínas.

Los segmentos individuales se descongelarán en hielo y se homogeneizarán inmediatamente después de la descongelación. Los métodos de homogeneización se optimizarán para producir el mayor contenido de proteínas disueltas. Los métodos que se probarán incluirán la sonicación, la disrupción mecánica con una licuadora de laboratorio, la disrupción mecánica mediante el corte manual seguido del dispositivo Potter y la congelación y descongelación.

Las variables del sistema de tampones y solventes que se probarán incluyen la concentración de sal, el pH y el tipo de tampón, la concentración de caotropos (urea y tiourea), la presencia de codisolventes orgánicos como DMSO y la presencia de detergente no iónico. Toda homogeneización se realizará entre 0 y 4°C y en presencia de inhibidores de proteasa.

Para el análisis proteómico, se empleará cromatografía líquida de alto rendimiento/espectrometría de masas por electropulverización como ruta complementaria para descubrir diferencias en la expresión de proteínas entre tejidos sanos y traumatizados. Después de la extracción en fase sólida de proteínas solubles y solubilizadas, optimizaremos las condiciones para la separación de los picos de proteína detectados por absorbancia UV y/o corriente iónica total y podemos emplear más de un conjunto de condiciones para enfocarnos en diferentes conjuntos de proteínas extraídas. Usaremos columnas de fase reversa C-18 de alta porosidad para separar proteínas citosólicas y C-4 para proteínas de membrana. Se utilizarán métodos estándar de ionización, fragmentación y detección que sean consistentes con el espectrómetro de masas Shimadzu LCMS-IT-TOF en el Servicio de Operaciones de Investigación (ROS).

Para el análisis de ARN, el ARN extraído se llevará al núcleo de Tecnologías genómicas del Centro Duke de Genómica y Biología Computacional. Allí, la calidad del ARN se determinará utilizando un bioanalizador Agilent 2100 seguido de un análisis Affymetrix GeneChip. David Corcoran, el bioestadístico que trabaja en el Centro Duke de Biología Genómica y Computacional, realizará el análisis de datos.

En este estudio, no se implementarán cambios en el estándar de atención. De lo contrario, las muestras del nervio ciático se descartarían como tejido humano; no hay otras investigaciones en curso que utilicen estos especímenes.

Tras el análisis del nervio ciático, recopilaremos datos (información demográfica, de lesiones y tratamiento del dolor, así como puntuaciones de dolor preoperatorias) de las historias clínicas de los sujetos para determinar las variables de resultado secundarias. (Consulte el Apéndice B - Formularios de informe de casos)