SEXI: Ischiasuttryck och identifiering av differentiella proteiner i traumatiserade kontra icke-traumatiserade nerver (SEXI)

Försökspersoner som är planerade för slutlig amputationsrevision och stängning(er) kommer att kontaktas för att delta i studien. På dagen för studiedeltagarens planerade amputationsrevision kommer forskarpersonalen att ha kontakt med kirurgisk personal för att koordinera uttagningen av nervprover. Om en patient ska ha en amputation ovanför knäet kommer ett ischiasnervprov att tas, om en patient ska ha en under knäet eller genom knäamputation kommer ett tibialisnervprov att erhållas (huvudkomponenten i ischiasnerven efter att den delar sig i tibial- och peronealnerverna i knäets poplitealfossa). Kirurgen kommer att placera en sutur i den proximala änden av provet för att indikera den icke-traumatiserade änden av nerven, samt ge en uppskattning av den longitudinella platsen för den provade nerven (dvs. 10 cm distalt till knäledslinjen, 15 cm proximalt till knäet i knäledsnivå). Varje prov kommer att skäras ut på samma sätt - med en skalpell. När vävnaden har skurits ut av kirurgen kommer den att placeras i ett plastprovrör som är märkt med försökspersonernas studieidentifikationsnummer (med suffixet "A" eller "B" om två prover hämtas från den patienten), överförs till en medlem av forskarpersonalen och omedelbart fryst i flytande kväve. Det frysta provet kommer sedan att levereras till Institutionen för forskningsprograms laboratorium där det kommer att förvaras vid -80°C före analys. De promixala, mitten och distala proverna kommer att erhållas vid DRP-labbet och de återstående nervsegmenten kommer att ersättas i -80-frysen för framtida analys. Prover kommer sedan att skickas till Duke University för bearbetning och analys via ett säkert luftpostföretag. Uppgiften att bearbeta prover kommer att utföras omedelbart före masspektroskopianalys av kollegor vid Duke University. Samarbetspartner Dr Moseleys labbansvar inkluderar både proteinextraktion och analys. Antalet extraktioner per prov kommer att variera beroende på dess längd, från 2 till cirka 50. Samarbetspartner Dr Van devens labbansvar inkluderar provhantering, patologisk undersökning, borttagning av tunna skivor för histologisk undersökning och segmenthomogenisering för RNA, DNA och proteinextraktion.

Enskilda segment kommer att tinas på is och homogeniseras omedelbart efter upptining. Homogeniseringsmetoder kommer att optimeras för att producera den högsta halten löst protein. Metoder som ska testas inkluderar ultraljudsbehandling, mekanisk störning med laboratorieblandare, mekanisk störning genom manuell hackning följt av Potter-apparat och frysupptining.

Buffert- och lösningsmedelssystemvariabler som ska testas inkluderar saltkoncentration, pH och bufferttyp, kaotropkoncentration (urea och tiourea), närvaro av organiska hjälplösningsmedel såsom DMSO och närvaro av nonjonisk detergent. All homogenisering kommer att utföras mellan 0 och 4°C och i närvaro av proteashämmare.

För proteomisk analys kommer högpresterande vätskekromatografi/elektrospraymasspektrometri att användas som en kompletterande väg för att upptäcka skillnader i proteinuttryck mellan frisk och traumatiserad vävnad. Efter fastfasextraktion av lösliga och solubiliserade proteiner kommer vi att optimera förhållanden för separation av proteintoppar som detekteras av UV-absorbans och/eller total jonström och kan använda mer än en uppsättning villkor för att fokusera på olika uppsättningar av extraherade proteiner. Vi kommer att använda högporositet C-18 omvänd faskolonner för att separera cytosoliska proteiner och C-4 för membranproteiner. Standardmetoder för jonisering, fragmentering och detektion kommer att användas som är förenliga med Shimadzu LCMS-IT-TOF masspektrometer vid Research Operations Service (ROS).

För RNA-analys kommer extraherat RNA att föras till kärnan i Duke Center for Genomic and Computational Biology Genomic Technologies. Där kommer RNA-kvaliteten att bestämmas med hjälp av en Agilent 2100bioanalyzer följt av Affymetrix GeneChip-analys. David Corcoran, biostatistikern som arbetar vid Duke Center for Genomic and Computational Biology, kommer att utföra dataanalys.

I denna studie kommer inga förändringar av vårdstandarden att genomföras. Ischiasnervens prover skulle annars kasseras som mänsklig vävnad; det finns inga andra pågående undersökningar med dessa prover.

Efter analysen av ischiasnerven kommer vi att samla in data – demografisk, skada och smärtbehandlingsinformation, såväl som preoperativa smärtpoäng – från försökspersoners diagram för att fastställa sekundära utfallsvariabler. (Se bilaga B - Fallrapportformulär)