SEXI : expression sciatique et identification des protéines différentielles dans les nerfs traumatisés par rapport aux nerfs non traumatisés (SEXI)

Les sujets devant subir une révision d'amputation finale et une ou plusieurs fermetures seront approchés pour participer à l'étude. Le jour de la révision de l'amputation planifiée du participant à l'étude, le personnel de recherche assurera la liaison avec le personnel chirurgical pour coordonner le prélèvement des échantillons nerveux. Si un patient doit avoir une amputation au-dessus du genou, un échantillon de nerf sciatique sera obtenu, si un patient doit avoir une amputation au-dessous du genou ou à travers le genou, un échantillon de nerf tibial sera obtenu (le composant principal du nerf sciatique après qu'il se divise en nerfs tibial et péronier dans la fosse poplitée du genou). Le chirurgien placera une suture dans l'extrémité proximale de l'échantillon pour indiquer l'extrémité non traumatisée du nerf, ainsi que pour fournir une estimation de l'emplacement longitudinal du nerf échantillonné (c'est-à-dire 10 cm distalement à la ligne articulaire du genou, 15 cm proximalement au genou au niveau de l'articulation du genou). Chaque échantillon sera excisé de la même manière - à l'aide d'un scalpel. Une fois le tissu excisé par le chirurgien, il sera placé dans un tube à essai en plastique étiqueté avec le numéro d'identification de l'étude des sujets (avec le suffixe « A » ou « B » si deux échantillons sont prélevés sur ce sujet), transféré à un membre du personnel de recherche et immédiatement congelé dans de l'azote liquide. L'échantillon congelé sera ensuite livré au laboratoire du Département des programmes de recherche où il sera stocké à -80°C avant l'analyse. Les échantillons promixal, moyen et distal seront obtenus au laboratoire DRP et les segments de nerf restants seront remplacés dans le congélateur -80 pour une analyse future. Les échantillons seront ensuite envoyés à l'Université Duke pour traitement et analyse via un transporteur aérien sécurisé. La tâche de traitement des échantillons sera effectuée immédiatement avant l'analyse par spectroscopie de masse par des collègues de l'Université Duke. Les responsabilités de laboratoire du collaborateur Dr Moseley comprennent à la fois l'extraction et le dosage des protéines. Le nombre d'extractions par échantillon variera en fonction de sa longueur, de 2 à environ 50. Les responsabilités de laboratoire du collaborateur Dr Van de ven comprennent la manipulation des échantillons, l'examen pathologique, le retrait de fines tranches pour l'examen histologique et l'homogénéisation des segments pour l'extraction de l'ARN, de l'ADN et des protéines.

Les segments individuels seront décongelés sur de la glace et homogénéisés immédiatement après décongélation. Les méthodes d'homogénéisation seront optimisées pour produire la plus haute teneur en protéines dissoutes. Les méthodes à tester comprendront la sonication, la perturbation mécanique par un mélangeur de laboratoire, la perturbation mécanique par hachage manuel suivi d'un appareil Potter et la congélation-décongélation.

Les variables du système de tampon et de solvant à tester comprennent la concentration de sel, le pH et le type de tampon, la concentration de chaotrope (urée et thiourée), la présence de co-solvants organiques tels que le DMSO et la présence de détergent non ionique. Toutes les homogénéisations seront réalisées entre 0 et 4°C et en présence d'inhibiteurs de protéase.

Pour l'analyse protéomique, la chromatographie liquide haute performance/spectrométrie de masse par électrospray sera utilisée comme voie complémentaire pour découvrir les différences d'expression des protéines entre les tissus sains et traumatisés. Après l'extraction en phase solide des protéines solubles et solubilisées, nous optimiserons les conditions de séparation des pics de protéines détectés par l'absorbance UV et/ou le courant ionique total et nous pourrons utiliser plus d'un ensemble de conditions afin de nous concentrer sur différents ensembles de protéines extraites. Nous utiliserons des colonnes en phase inverse C-18 à haute porosité pour séparer les protéines cytosoliques et C-4 pour les protéines membranaires. Des méthodes standard d'ionisation, de fragmentation et de détection seront utilisées qui sont compatibles avec le spectromètre de masse Shimadzu LCMS-IT-TOF du Service des opérations de recherche (ROS).

Pour l'analyse de l'ARN, l'ARN extrait sera amené au centre Duke Center for Genomic and Computational Biology Genomic Technologies. Là, la qualité de l'ARN sera déterminée à l'aide d'un bioanalyseur Agilent 2100 suivi d'une analyse Affymetrix GeneChip. David Corcoran, le biostatisticien qui travaille au Duke Center for Genomic and Computational Biology, effectuera l'analyse des données.

Dans cette étude, aucune modification de la norme de soins ne sera mise en œuvre. Les spécimens de nerf sciatique seraient autrement jetés en tant que tissus humains; il n'y a pas d'autres enquêtes en cours utilisant ces spécimens.

Suite à l'analyse du nerf sciatique, nous collecterons des données - informations démographiques, sur les blessures et le traitement de la douleur, ainsi que les scores de douleur préopératoire - à partir des dossiers des sujets afin de déterminer les variables de résultats secondaires. (Voir Annexe B - Formulaires de rapport de cas)