SEXI: Iskiasekspression og identifikation af differentielle proteiner i traumatiserede versus ikke-traumatiserede nerver (SEXI)

Forsøgspersoner, der er planlagt til endelig amputationsrevision og lukning(er), vil blive kontaktet for at deltage i undersøgelsen. På dagen for forsøgsdeltagerens planlagte amputationsrevision vil forskningspersonalet have kontakt med kirurgisk personale for at koordinere udtagning af nerveprøver. Hvis en patient skal have en amputation over knæet, vil der blive taget en ischiasnerveprøve, hvis en patient skal have en under knæet eller gennem knæamputation, vil der blive udtaget en tibial nerveprøve (hovedkomponenten af ​​ischiasnerven efter at den deler sig i tibiale og peroneale nerver i knæets popliteal fossa). Kirurgen vil placere en sutur i den proksimale ende af prøven for at indikere den ikke-traumatiserede ende af nerven, samt give et estimat af den langsgående placering af den prøvede nerve (dvs. 10 cm distalt til knæleddets linje, 15 cm proksimalt i forhold til knæet i knæleddets niveau). Hver prøve vil blive skåret ud på samme måde - ved hjælp af en skalpel. Når vævet er skåret ud af kirurgen, vil det blive anbragt i et plastikreagensglas, der er mærket med forsøgspersonernes undersøgelses identifikationsnummer (med suffikset "A" eller "B", hvis der hentes to prøver fra det pågældende forsøgsperson). overføres til et medlem af forskningsstaben og straks nedfryses i flydende nitrogen. Den frosne prøve vil derefter blive leveret til Institut for forskningsprogrammers laboratorium, hvor den vil blive opbevaret ved -80°C før analyse. De promixale, mellemste og distale prøver vil blive opnået i DRP-laboratoriet, og de resterende nervesegmenter vil blive erstattet i -80-fryseren til fremtidig analyse. Prøver vil derefter blive sendt til Duke University til behandling og analyse via et sikkert luftpostselskab. Opgaven med at behandle prøver vil blive udført umiddelbart før massespektroskopianalyse af kolleger ved Duke University. Samarbejdspartner Dr. Moseleys laboratorieansvar omfatter både proteinekstraktion og assay. Antallet af ekstraktioner pr. prøve vil variere afhængigt af dens længde, fra 2 til omkring 50. Samarbejdspartner Dr. Van de vens laboratorieansvar omfatter prøvehåndtering, patologisk undersøgelse, fjernelse af tynde skiver til histologisk undersøgelse og segmenthomogenisering til RNA, DNA og proteinekstraktion.

Individuelle segmenter vil blive optøet på is og homogeniseret umiddelbart efter optøning. Homogeniseringsmetoder vil blive optimeret til at producere det højeste indhold af opløst protein. Metoder, der skal afprøves, vil omfatte sonikering, mekanisk afbrydelse med laboratorieblender, mekanisk afbrydelse ved manuel hakning efterfulgt af Potter-anordning og fryseoptøning.

Buffer- og opløsningsmiddelsystemvariabler, der skal afprøves, omfatter saltkoncentration, pH og buffertype, chaotropkoncentration (urinstof og thiourinstof), tilstedeværelse af organiske hjælpeopløsningsmidler såsom DMSO og tilstedeværelsen af ​​ikke-ionisk detergent. Al homogenisering vil blive udført mellem 0 og 4°C og i nærvær af proteaseinhibitorer.

Til proteomisk analyse vil højtydende væskekromatografi/elektrospray-massespektrometri blive brugt som en komplementær vej til at opdage forskelle i proteinekspression mellem sundt og traumatiseret væv. Efter fastfaseekstraktion af opløselige og solubiliserede proteiner vil vi optimere betingelserne for adskillelse af proteintoppe detekteret ved UV-absorbans og/eller total ionstrøm og kan anvende mere end ét sæt betingelser for at fokusere på forskellige sæt ekstraherede proteiner. Vi vil bruge højporøsitet C-18 omvendt fase-søjler til at adskille cytosoliske proteiner og C-4 til membranproteiner. Standardmetoder til ionisering, fragmentering og detektion vil blive brugt, som er i overensstemmelse med Shimadzu LCMS-IT-TOF massespektrometeret hos Research Operations Service (ROS).

Til RNA-analyse vil ekstraheret RNA blive bragt til Duke Center for Genomic and Computational Biology Genomic Technologies kerne. Der vil RNA-kvaliteten blive bestemt ved hjælp af en Agilent 2100bioanalyzer efterfulgt af Affymetrix GeneChip-analyse. David Corcoran, biostatistikeren, der arbejder på Duke Center for Genomic and Computational Biology, vil udføre dataanalyse.

I denne undersøgelse vil der ikke blive implementeret ændringer i plejestandarden. Iskiasnerveprøverne ville ellers blive kasseret som menneskeligt væv; der er ingen andre igangværende undersøgelser med disse prøver.

Efter analysen af ​​ischiasnerven vil vi indsamle data - demografiske, skader og smertebehandlingsoplysninger samt præoperative smertescore - fra forsøgspersoners diagrammer for at bestemme sekundære udfaldsvariabler. (Se bilag B - Sagsrapportformularer)