SEXI: Ekspresja kulszowa i identyfikacja białek różnicowych w nerwach urazowych i nieuszkodzonych (SEXI)

Pacjenci, u których zaplanowano ostateczną rewizję amputacji i zamknięcie(a) zostaną poproszone o udział w badaniu. W dniu planowanej rewizji amputacji uczestnika badania personel naukowy będzie współpracował z personelem chirurgicznym w celu skoordynowania pobierania próbek nerwów. Jeśli pacjent ma mieć amputację powyżej kolana, zostanie pobrany wycinek nerwu kulszowego, jeśli pacjent ma mieć amputację poniżej kolana lub przez kolano, zostanie pobrany wycinek nerwu piszczelowego (główny składnik nerwu kulszowego po podziale na nerw piszczelowy i strzałkowy w dole podkolanowym kolana). Chirurg założy szew na proksymalnym końcu próbki, aby wskazać nieuszkodzony koniec nerwu, a także oszacować podłużne położenie pobranego nerwu (tj. 10 cm dystalnie od linii stawu kolanowego, 15 cm proksymalnie od kolana na poziomie stawu kolanowego). Każda próbka zostanie wycięta w ten sam sposób – skalpelem. Po wycięciu tkanki przez chirurga zostanie ona umieszczona w plastikowej probówce oznaczonej numerem identyfikacyjnym badania pacjenta (z przyrostkiem „A” lub „B”, jeśli od tego pacjenta pobierane są dwie próbki), przekazane członkowi personelu badawczego i natychmiast zamrożone w ciekłym azocie. Zamrożona próbka zostanie następnie dostarczona do laboratorium Departamentu Programów Badawczych, gdzie przed analizą będzie przechowywana w temperaturze -80°C. Promiksalne, środkowe i dystalne próbki zostaną pobrane w laboratorium DRP, a pozostałe segmenty nerwu zostaną wymienione w zamrażarce -80 do przyszłej analizy. Próbki zostaną następnie przesłane do Duke University w celu przetworzenia i analizy za pośrednictwem bezpiecznej poczty lotniczej. Zadanie przetwarzania próbek zostanie wykonane bezpośrednio przed analizą spektroskopii mas przez kolegów z Duke University. Obowiązki laboratoryjne współpracownika dr Moseleya obejmują zarówno ekstrakcję białek, jak i testy. Liczba ekstrakcji na próbkę będzie różna w zależności od jej długości, od 2 do około 50. Do obowiązków laboratorium współpracownika dr Van de Vena należy obchodzenie się z próbkami, badanie patologiczne, usuwanie cienkich skrawków do badania histologicznego oraz homogenizacja segmentów w celu ekstrakcji RNA, DNA i białek.

Poszczególne segmenty będą rozmrażane na lodzie i homogenizowane natychmiast po rozmrożeniu. Metody homogenizacji zostaną zoptymalizowane w celu uzyskania najwyższej zawartości rozpuszczonego białka. Metody, które zostaną przetestowane, będą obejmować sonikację, rozbijanie mechaniczne za pomocą blendera laboratoryjnego, rozbijanie mechaniczne przez ręczne siekanie, a następnie urządzenie Pottera oraz zamrażanie i rozmrażanie.

Zmienne systemu buforów i rozpuszczalników, które mają zostać przetestowane, obejmują stężenie soli, pH i typ buforu, stężenie chaotropu (mocznika i tiomocznika), obecność współrozpuszczalników organicznych, takich jak DMSO, oraz obecność niejonowego detergentu. Cała homogenizacja zostanie przeprowadzona w temperaturze od 0 do 4°C iw obecności inhibitorów proteazy.

Do analizy proteomicznej wykorzystana zostanie wysokosprawna chromatografia cieczowa/spektrometria mas z elektrorozpylaniem jako uzupełniająca droga do odkrycia różnic w ekspresji białek między tkanką zdrową a uszkodzoną. Po ekstrakcji rozpuszczalnych i solubilizowanych białek w fazie stałej zoptymalizujemy warunki rozdzielania pików białkowych wykrywanych przez absorbancję UV i/lub całkowity prąd jonowy i możemy zastosować więcej niż jeden zestaw warunków, aby skupić się na różnych zestawach wyekstrahowanych białek. Do separacji białek cytozolowych wykorzystamy wysokoporowate kolumny C-18 z odwróconą fazą, a do białek błonowych C-4. Zastosowane zostaną standardowe metody jonizacji, fragmentacji i detekcji, które są zgodne ze spektrometrem masowym Shimadzu LCMS-IT-TOF w Research Operations Service (ROS).

W celu analizy RNA, wyekstrahowany RNA zostanie dostarczony do rdzenia Duke Center for Genomic and Computational Biology Genomic Technologies. Tam jakość RNA zostanie określona za pomocą bioanalizatora Agilent 2100, a następnie przeprowadzona zostanie analiza Affymetrix GeneChip. David Corcoran, biostatystyk pracujący w Duke Center for Genomic and Computational Biology, przeprowadzi analizę danych.

W tym badaniu nie zostaną wprowadzone żadne zmiany w standardzie opieki. W przeciwnym razie próbki nerwu kulszowego zostałyby odrzucone jako tkanka ludzka; nie ma innych toczących się badań z wykorzystaniem tych okazów.

Po analizie nerwu kulszowego zbierzemy dane – dane demograficzne, urazy i leczenie bólu, a także przedoperacyjne oceny bólu – z wykresów pacjentów, aby określić drugorzędne zmienne wyniku. (Patrz Załącznik B – Formularze opisów przypadków)