SEXI: экспрессия седалищного нерва и идентификация дифференциальных белков в травмированных и нетравматизированных нервах (SEXI)

Субъектам, запланированным для окончательной ревизии ампутации и закрытия(ий), будет предложено принять участие в исследовании. В день запланированной ревизии ампутации участника исследования исследовательский персонал свяжется с хирургическим персоналом для координации извлечения образца нерва. Если у пациента должна быть ампутация выше колена, будет получен образец седалищного нерва, если у пациента должна быть ампутация ниже колена или через колено, будет получен образец большеберцового нерва (основной компонент седалищного нерва). после делится на большеберцовый и малоберцовый нервы в подколенной ямке колена). Хирург наложит шов на проксимальный конец образца, чтобы указать нетравматизированный конец нерва, а также оценить продольное расположение взятого образца нерва (т. 10 см дистальнее линии коленного сустава, 15 см проксимальнее колена на уровне коленного сустава). Каждый образец будет иссечен одинаковым образом – с помощью скальпеля. После того, как хирург иссечет ткань, она будет помещена в пластиковую пробирку, на которой указан идентификационный номер исследования субъекта (с суффиксом «A» или «B», если у этого субъекта извлекаются два образца). переданы члену исследовательского персонала и немедленно заморожены в жидком азоте. Затем замороженный образец будет доставлен в лабораторию Департамента исследовательских программ, где он будет храниться при температуре -80°C до проведения анализа. Промиксальные, средние и дистальные образцы будут получены в лаборатории DRP, а оставшиеся сегменты нерва будут заменены в морозильной камере -80 для дальнейшего анализа. Затем образцы будут отправлены в Университет Дьюка для обработки и анализа безопасным авиапочтовым перевозчиком. Задача обработки образцов будет выполняться непосредственно перед масс-спектроскопическим анализом коллегами из Университета Дьюка. В обязанности сотрудника лаборатории доктора Мозли входит как выделение белка, так и его анализ. Количество извлечений на образец будет варьироваться в зависимости от его длины, от 2 до примерно 50. В обязанности сотрудника лаборатории доктора Ван девена входит работа с образцами, патологоанатомическое исследование, удаление тонких срезов для гистологического исследования и гомогенизация сегментов для выделения РНК, ДНК и белков.

Отдельные сегменты размораживают на льду и гомогенизируют сразу после оттаивания. Методы гомогенизации будут оптимизированы для получения максимального содержания растворенного белка. Методы, которые будут опробованы, будут включать обработку ультразвуком, механическое разрушение с помощью лабораторного блендера, механическое разрушение путем измельчения вручную с последующим использованием устройства Поттера и замораживание-оттаивание.

Переменные системы буфера и растворителя, которые необходимо испытать, включают концентрацию соли, рН и тип буфера, концентрацию хаотропа (мочевина и тиомочевина), присутствие органических сорастворителей, таких как ДМСО, и присутствие неионогенного детергента. Всю гомогенизацию проводят при температуре от 0 до 4°C и в присутствии ингибиторов протеазы.

Для протеомного анализа будет использоваться высокоэффективная жидкостная хроматография/масс-спектрометрия с электрораспылением в качестве дополнительного способа обнаружения различий в экспрессии белка между здоровой и травмированной тканью. После твердофазной экстракции растворимых и солюбилизированных белков мы оптимизируем условия для разделения белковых пиков, обнаруженных по УФ-поглощению и/или общему ионному току, и можем использовать более одного набора условий, чтобы сосредоточиться на разных наборах экстрагированных белков. Мы будем использовать высокопористые обращенно-фазовые колонки C-18 для разделения цитозольных белков и C-4 для мембранных белков. Будут использоваться стандартные методы ионизации, фрагментации и обнаружения, совместимые с масс-спектрометром Shimadzu LCMS-IT-TOF Службы исследовательских операций (ROS).

Для анализа РНК извлеченная РНК будет доставлена ​​в центр геномных технологий Duke Center for Genomic and Computational Biology. Там качество РНК будет определяться с помощью биоанализатора Agilent 2100 с последующим анализом Affymetrix GeneChip. Дэвид Коркоран, специалист по биостатистике, работающий в Центре геномной и вычислительной биологии Дьюка, проведет анализ данных.

В этом исследовании не будет внесено никаких изменений в стандарт медицинской помощи. В противном случае образцы седалищного нерва были бы выброшены как человеческие ткани; никаких других текущих исследований с использованием этих образцов не ведется.

После анализа седалищного нерва мы соберем данные — демографические данные, информацию о травмах и лечении боли, а также предоперационные оценки боли — из диаграмм субъектов, чтобы определить вторичные переменные результата. (См. Приложение B – Формы истории болезни)