SEXI: Isjiasuttrykk og identifisering av differensielle proteiner i traumatiserte versus ikke-traumatiserte nerver (SEXI)

Emner som er planlagt for endelig amputasjonsrevisjon og lukking(er) vil bli kontaktet for å delta i studien. På dagen for studiedeltakerens planlagte amputasjonsrevisjon, vil forskningspersonell ha kontakt med kirurgisk personale for å koordinere uthenting av nerveprøver. Hvis en pasient skal ha en amputasjon over kneet, vil en isjiasnerveprøve bli tatt, hvis en pasient skal ha en under kneet eller gjennom kneamputasjon, vil en tibial nerveprøve bli tatt (hovedkomponenten i isjiasnerven etter at den deler seg i tibiale og peroneale nerver i kneets popliteal fossa). Kirurgen vil plassere en sutur i den proksimale enden av prøven for å indikere den ikke-traumatiserte enden av nerven, samt gi et estimat av den langsgående plasseringen av nerven som er tatt (dvs. 10 cm distalt til kneleddslinjen, 15 cm proksimalt til kneet på kneleddsnivå). Hver prøve vil bli skåret ut på samme måte - med en skalpell. Når vevet er skåret ut av kirurgen, vil det bli plassert i et plastreagensrør som er merket med forsøkspersonens studieidentifikasjonsnummer (med suffikset "A" eller "B" hvis to prøver hentes fra det emnet), overføres til et medlem av forskningsstaben og umiddelbart fryses ned i flytende nitrogen. Den frosne prøven vil deretter bli levert til Institutt for forskningsprogrammers laboratorium hvor den vil bli lagret ved -80 °C før analyse. De promiksale, midtre og distale prøvene vil bli innhentet på DRP-laboratoriet, og de resterende nervesegmentene vil bli erstattet i -80-fryseren for fremtidig analyse. Prøver vil deretter bli sendt til Duke University for behandling og analyse via et sikkert luftpostselskap. Oppgaven med å behandle prøver vil bli utført umiddelbart før massespektroskopianalyse av kolleger ved Duke University. Samarbeidspartner Dr Moseleys laboratorieansvar inkluderer både proteinekstraksjon og analyse. Antall ekstraksjoner per prøve vil variere avhengig av lengden, fra 2 til omtrent 50. Samarbeidspartner Dr Van de vens laboratorieansvar inkluderer prøvehåndtering, patologisk undersøkelse, fjerning av tynne skiver for histologisk undersøkelse og segmenthomogenisering for RNA, DNA og proteinekstraksjon.

Individuelle segmenter vil bli tint på is og homogenisert umiddelbart etter tining. Homogeniseringsmetoder vil bli optimalisert for å produsere det høyeste innholdet av oppløst protein. Metoder som skal prøves ut vil inkludere sonikering, mekanisk forstyrrelse med laboratoriemikser, mekanisk forstyrrelse ved manuell kutting etterfulgt av Potter-apparat, og frysetining.

Buffer- og løsningsmiddelsystemvariabler som skal testes inkluderer saltkonsentrasjon, pH og buffertype, kaotrop konsentrasjon (urea og tiourea), tilstedeværelse av organiske hjelpeløsningsmidler som DMSO og tilstedeværelse av ikke-ionisk vaskemiddel. All homogenisering vil bli utført mellom 0 og 4°C og i nærvær av proteasehemmere.

For proteomisk analyse vil høyytelses væskekromatografi/elektrospray massespektrometri bli brukt som en komplementær vei for å oppdage forskjeller i proteinuttrykk mellom sunt og traumatisert vev. Etter fastfase-ekstraksjon av løselige og solubiliserte proteiner, vil vi optimalisere forholdene for separasjon av proteintopper påvist av UV-absorbans og/eller total ionestrøm og kan bruke mer enn ett sett med betingelser for å fokusere på forskjellige sett med ekstraherte proteiner. Vi vil bruke høyporøsitet C-18 revers-fase kolonner for å skille cytosoliske proteiner, og C-4 for membranproteiner. Standardmetoder for ionisering, fragmentering og deteksjon vil bli brukt som er i samsvar med Shimadzu LCMS-IT-TOF massespektrometer ved Research Operations Service (ROS).

For RNA-analyse vil ekstrahert RNA bli brakt til kjernen Duke Center for Genomic and Computational Biology Genomic Technologies. Der vil RNA-kvalitet bli bestemt ved hjelp av en Agilent 2100bioanalyzer etterfulgt av Affymetrix GeneChip-analyse. David Corcoran, biostatistikeren som jobber ved Duke Center for Genomic and Computational Biology, vil utføre dataanalyse.

I denne studien vil ingen endringer i omsorgsstandarden bli implementert. Isjiasnerveprøvene ville ellers bli kastet som menneskelig vev; det er ingen andre pågående undersøkelser som bruker disse prøvene.

Etter analysen av isjiasnerven, vil vi samle inn data – demografisk informasjon, skade- og smertebehandlingsinformasjon, samt preoperative smertescore – fra forsøkspersonens diagrammer for å bestemme sekundære utfallsvariabler. (Se vedlegg B – Saksrapportskjemaer)