SEXI: heupexpressie en identificatie van differentiële eiwitten in getraumatiseerde versus niet-getraumatiseerde zenuwen (SEXI)

Proefpersonen die zijn ingepland voor definitieve amputatierevisie en sluiting(en) zullen worden benaderd om deel te nemen aan het onderzoek. Op de dag van de geplande amputatierevisie van de studiedeelnemer zal het onderzoekspersoneel contact opnemen met het chirurgisch personeel om het ophalen van zenuwspecimens te coördineren. Als een patiënt een amputatie boven de knie moet ondergaan, zal een heupzenuwmonster worden verkregen, als een patiënt een amputatie onder de knie of door de knie moet ondergaan, zal een scheenbeenzenuwmonster worden verkregen (het belangrijkste onderdeel van de heupzenuw nadat het zich heeft verdeeld in de tibiale en peroneale zenuwen in de fossa poplitea van de knie). De chirurg plaatst een hechtdraad in het proximale uiteinde van het monster om het niet-getraumatiseerde uiteinde van de zenuw aan te geven, en geeft ook een schatting van de longitudinale locatie van de bemonsterde zenuw (d.w.z. 10 cm distaal van de kniegewrichtlijn, 15 cm proximaal van de knie ter hoogte van het kniegewricht). Elk monster wordt op dezelfde manier uitgesneden - met behulp van een scalpel. Zodra het weefsel door de chirurg is weggesneden, wordt het in een plastic reageerbuis geplaatst die is gelabeld met het studie-identificatienummer van de proefpersoon (met het achtervoegsel "A" of "B" als er twee monsters van die proefpersoon worden opgehaald), overgedragen aan een lid van het onderzoekspersoneel en onmiddellijk ingevroren in vloeibare stikstof. Het ingevroren monster wordt vervolgens afgeleverd bij het laboratorium van het Department of Research Programs, waar het vóór analyse bij -80°C wordt bewaard. De promixale, middelste en distale monsters zullen worden verkregen in het DRP-laboratorium en de resterende zenuwsegmenten zullen worden teruggeplaatst in de -80 vriezer voor toekomstige analyse. Monsters worden vervolgens via een beveiligde luchtpost naar Duke University gestuurd voor verwerking en analyse. De taak van het verwerken van monsters zal onmiddellijk voorafgaand aan massaspectroscopie-analyse worden uitgevoerd door collega's van Duke University. De laboratoriumverantwoordelijkheden van medewerker dr. Moseley omvatten zowel eiwitextractie als assay. Het aantal extracties per monster varieert afhankelijk van de lengte, van 2 tot ongeveer 50. De laboratoriumverantwoordelijkheden van medewerker dr. Van de ven omvatten het hanteren van monsters, pathologisch onderzoek, het verwijderen van dunne plakjes voor histologisch onderzoek en het homogeniseren van segmenten voor RNA-, DNA- en eiwitextractie.

Individuele segmenten worden op ijs ontdooid en onmiddellijk na ontdooien gehomogeniseerd. Homogenisatiemethoden zullen worden geoptimaliseerd om het hoogste opgeloste eiwitgehalte te produceren. Methoden die worden uitgeprobeerd, zijn onder meer ultrasoonapparaat, mechanische verstoring door laboratoriummenger, mechanische verstoring door handmatig hakken gevolgd door een Potter-apparaat en ontdooien in de vriezer.

Buffer- en oplosmiddelsysteemvariabelen die getest moeten worden, omvatten zoutconcentratie, pH en buffertype, chaotroopconcentratie (ureum en thioureum), aanwezigheid van organische hulpoplosmiddelen zoals DMSO en de aanwezigheid van niet-ionisch detergens. Alle homogenisatie zal worden uitgevoerd tussen 0 en 4°C en in aanwezigheid van proteaseremmers.

Voor proteomische analyse zal hogedrukvloeistofchromatografie/electrospray-massaspectrometrie worden gebruikt als aanvullende route om verschillen in eiwitexpressie tussen gezond en getraumatiseerd weefsel te ontdekken. Na vaste-fase-extractie van oplosbare en oplosbaar gemaakte eiwitten, zullen we de omstandigheden optimaliseren voor de scheiding van eiwitpieken die worden gedetecteerd door UV-absorptie en/of totale ionenstroom en kunnen we meer dan één set voorwaarden gebruiken om ons te concentreren op verschillende sets geëxtraheerde eiwitten. We zullen C-18-kolommen met omgekeerde fase met hoge porositeit gebruiken om cytosolische eiwitten te scheiden, en C-4 voor membraaneiwitten. Standaard methoden van ionisatie, fragmentatie en detectie zullen worden gebruikt die consistent zijn met de Shimadzu LCMS-IT-TOF massaspectrometer bij de Research Operations Service (ROS).

Voor RNA-analyse wordt geëxtraheerd RNA naar de Duke Center for Genomic and Computational Biology Genomic Technologies-kern gebracht. Daar zal de RNA-kwaliteit worden bepaald met behulp van een Agilent 2100bioanalyzer gevolgd door Affymetrix GeneChip-analyse. David Corcoran, de biostatisticus die werkt bij het Duke Centre for Genomic and Computational Biology, zal data-analyse uitvoeren.

In dit onderzoek worden geen wijzigingen in de zorgstandaard doorgevoerd. De heupzenuwspecimens zouden anders als menselijk weefsel worden weggegooid; er zijn geen andere lopende onderzoeken waarbij deze exemplaren worden gebruikt.

Na de analyse van de heupzenuw verzamelen we gegevens - demografische informatie, letsel- en pijnbehandelingsinformatie, evenals preoperatieve pijnscores - uit de grafieken van proefpersonen om secundaire uitkomstvariabelen te bepalen. (Zie Bijlage B - Casusrapportformulieren)