SEXI: Espressione sciatica e identificazione di proteine ​​​​differenziali nei nervi traumatizzati rispetto a quelli non traumatizzati (SEXI)

I soggetti programmati per la revisione e la chiusura dell'amputazione finale saranno contattati per partecipare allo studio. Il giorno della prevista revisione dell'amputazione del partecipante allo studio, il personale di ricerca collaborerà con il personale chirurgico per coordinare il recupero del campione di nervi. Se un paziente deve avere un'amputazione sopra il ginocchio, si otterrà un campione di nervo sciatico, se un paziente deve avere un'amputazione sotto il ginocchio o attraverso il ginocchio, si otterrà un campione di nervo tibiale (il componente principale del nervo sciatico dopo che si divide nei nervi tibiale e peroneo nella fossa poplitea del ginocchio). Il chirurgo posizionerà una sutura nell'estremità prossimale del campione per indicare l'estremità non traumatizzata del nervo, oltre a fornire una stima della posizione longitudinale del nervo campionato (ad es. 10 cm distalmente alla linea dell'articolazione del ginocchio, 15 cm prossimalmente al ginocchio a livello dell'articolazione del ginocchio). Ogni campione verrà asportato allo stesso modo, utilizzando un bisturi. Una volta che il tessuto è stato asportato dal chirurgo, verrà posto in una provetta di plastica etichettata con il numero di identificazione dello studio del soggetto (con il suffisso "A" o "B" se vengono prelevati due campioni da quel soggetto), trasferito a un membro del personale di ricerca e immediatamente congelato in azoto liquido. Il campione congelato verrà quindi consegnato al laboratorio del Dipartimento dei Programmi di Ricerca dove verrà conservato a -80°C prima dell'analisi. I campioni promixale, medio e distale saranno ottenuti presso il laboratorio DRP e i restanti segmenti di nervo saranno sostituiti nel congelatore -80 per analisi future. I campioni verranno quindi inviati alla Duke University per l'elaborazione e l'analisi tramite un vettore di posta aerea sicuro. Il compito di elaborare i campioni verrà eseguito immediatamente prima dell'analisi di spettroscopia di massa dai colleghi della Duke University. Le responsabilità di laboratorio del collaboratore Dr Moseley includono sia l'estrazione delle proteine ​​che il dosaggio. Il numero di estrazioni per campione varierà a seconda della sua lunghezza, da 2 a circa 50. Le responsabilità di laboratorio del collaboratore Dr Van de ven includono la manipolazione dei campioni, l'esame patologico, la rimozione di fettine sottili per l'esame istologico e l'omogeneizzazione dei segmenti per l'estrazione di RNA, DNA e proteine.

I singoli segmenti saranno scongelati su ghiaccio e omogeneizzati immediatamente dopo lo scongelamento. I metodi di omogeneizzazione saranno ottimizzati per produrre il più alto contenuto di proteine ​​disciolte. I metodi da provare includeranno sonicazione, interruzione meccanica mediante miscelatore di laboratorio, interruzione meccanica mediante triturazione manuale seguita da dispositivo Potter e congelamento e scongelamento.

Le variabili del sistema tampone e solvente da testare includono la concentrazione salina, il pH e il tipo di tampone, la concentrazione di caotropo (urea e tiourea), la presenza di co-solventi organici come DMSO e la presenza di detergente non ionico. Tutte le omogeneizzazioni saranno effettuate tra 0 e 4°C e in presenza di inibitori della proteasi.

Per l'analisi proteomica, la cromatografia liquida ad alta prestazione/spettrometria di massa elettrospray sarà impiegata come percorso complementare per scoprire differenze nell'espressione proteica tra tessuto sano e traumatizzato. Dopo l'estrazione in fase solida di proteine ​​solubili e solubilizzate, ottimizzeremo le condizioni per la separazione dei picchi proteici rilevati dall'assorbanza UV e/o dalla corrente ionica totale e potremmo impiegare più di un set di condizioni per concentrarci su diversi set di proteine ​​estratte. Useremo colonne C-18 in fase inversa ad alta porosità per separare le proteine ​​citosoliche e C-4 per le proteine ​​di membrana. Verranno utilizzati metodi standard di ionizzazione, frammentazione e rilevamento coerenti con lo spettrometro di massa Shimadzu LCMS-IT-TOF presso il Research Operations Service (ROS).

Per l'analisi dell'RNA, l'RNA estratto sarà portato al centro Duke Center for Genomic and Computational Biology Genomic Technologies. Lì, la qualità dell'RNA sarà determinata utilizzando un bioanalizzatore Agilent 2100 seguito dall'analisi Affymetrix GeneChip. David Corcoran, il biostatistico che lavora al Duke Center for Genomic and Computational Biology, eseguirà l'analisi dei dati.

In questo studio non verranno implementate modifiche allo standard di cura. I campioni di nervo sciatico verrebbero altrimenti scartati come tessuto umano; non ci sono altre indagini in corso che utilizzano questi campioni.

Dopo l'analisi del nervo sciatico, raccoglieremo dati - informazioni demografiche, sulle lesioni e sul trattamento del dolore, nonché punteggi del dolore preoperatorio - dalle cartelle dei soggetti per determinare le variabili di esito secondarie. (Vedi Appendice B - Moduli di segnalazione dei casi)