SEXI: ischiatická exprese a identifikace diferenciálních proteinů u traumatizovaných versus netraumatizovaných nervů (SEXI)

Subjekty, u nichž je plánována konečná revize amputace a uzavření (uzavření), budou osloveni, aby se zúčastnili studie. V den plánované revize amputace účastníka studie se výzkumní pracovníci spojí s chirurgickým personálem za účelem koordinace odběru nervového vzorku. Pokud má pacient podstoupit amputaci nad kolenem, získá se vzorek sedacího nervu, pokud má mít pacient amputaci pod kolenem nebo přes koleno, získá se vzorek tibiálního nervu (hlavní složka sedacího nervu poté, co se dělí na tibiální a peroneální nerv v podkolenní jamce kolena). Chirurg umístí steh na proximální konec vzorku, aby označil netraumatizovaný konec nervu, a také odhadne podélné umístění odebraného nervu (tj. 10 cm distálně od linie kolenního kloubu, 15 cm proximálně od kolena na úrovni kolenního kloubu). Každý vzorek bude vyříznut stejným způsobem – pomocí skalpelu. Jakmile je tkáň vyříznuta chirurgem, bude umístěna do plastové zkumavky, která je označena identifikačním číslem studie (s příponou „A“ nebo „B“, pokud se od daného subjektu odebírají dva vzorky), převedena na člena výzkumného personálu a okamžitě zmrazena v kapalném dusíku. Zmrazený vzorek bude následně doručen do laboratoře Oddělení výzkumných programů, kde bude před analýzou skladován při -80°C. Promixální, střední a distální vzorky budou odebrány v laboratoři DRP a zbývající segmenty nervu budou nahrazeny v mrazničce -80 pro budoucí analýzu. Vzorky budou poté zaslány na Duke University ke zpracování a analýze prostřednictvím zabezpečeného leteckého poštovního dopravce. Úkol zpracování vzorků bude proveden bezprostředně před analýzou hmotnostní spektroskopií kolegy z Duke University. Laboratorní povinnosti spolupracovníka Dr. Moseleyho zahrnují jak extrakci proteinu, tak analýzu. Počet extrakcí na vzorek se bude lišit v závislosti na jeho délce, od 2 do přibližně 50. Mezi povinnosti laboratoře spolupracovníka Dr Van de Vena patří manipulace se vzorky, patologické vyšetření, odebírání tenkých plátků pro histologické vyšetření a homogenizace segmentů pro extrakci RNA, DNA a proteinů.

Jednotlivé segmenty budou rozmraženy na ledu a homogenizovány ihned po rozmrazení. Homogenizační metody budou optimalizovány tak, aby produkovaly co nejvyšší obsah rozpuštěných proteinů. Metody, které budou zkoušeny, budou zahrnovat sonikaci, mechanické rozrušení laboratorním mixérem, mechanické rozrušení ručním sekáním následovaným zařízením Potter a rozmrazování.

Proměnné systému pufrů a rozpouštědel, které mají být testovány, zahrnují koncentraci soli, pH a typ pufru, koncentraci chaotropu (močovina a thiomočovina), přítomnost organických pomocných rozpouštědel, jako je DMSO, a přítomnost neiontového detergentu. Veškerá homogenizace bude provedena mezi 0 a 4 °C a v přítomnosti inhibitorů proteázy.

Pro proteomickou analýzu bude použita vysokoúčinná kapalinová chromatografie/elektrosprejová hmotnostní spektrometrie jako doplňková cesta k odhalení rozdílů v expresi proteinů mezi zdravou a traumatizovanou tkání. Po extrakci rozpustných a solubilizovaných proteinů pevnou fází optimalizujeme podmínky pro separaci proteinových píku detekovaných UV absorbancí a/nebo celkovým iontovým proudem a můžeme použít více než jednu sadu podmínek, abychom se mohli zaměřit na různé soubory extrahovaných proteinů. K separaci cytosolických proteinů použijeme vysoce porézní kolony C-18 s reverzní fází a C-4 pro membránové proteiny. Budou použity standardní metody ionizace, fragmentace a detekce, které jsou v souladu s hmotnostním spektrometrem Shimadzu LCMS-IT-TOF ve Research Operations Service (ROS).

Pro analýzu RNA bude extrahovaná RNA přenesena do jádra Duke Center for Genomic and Computational Biology Genomic Technologies. Tam bude kvalita RNA stanovena pomocí bioanalyzátoru Agilent 2100 s následnou analýzou Affymetrix GeneChip. David Corcoran, biostatistik, který pracuje v Duke Center for Genomic and Computational Biology, provede analýzu dat.

V této studii nebudou provedeny žádné změny standardu péče. Vzorky ischiatického nervu by jinak byly vyřazeny jako lidská tkáň; neexistují žádná další probíhající vyšetřování s použitím těchto vzorků.

Po analýze sedacího nervu budeme shromažďovat data – demografické informace, informace o zranění a léčbě bolesti, stejně jako předoperační skóre bolesti – z tabulek subjektů, abychom určili sekundární výsledné proměnné. (Viz Příloha B – Formuláře hlášení případů)