SEXI: Iskiasinen ilme ja erilaisten proteiinien tunnistaminen traumatisoituneissa ja ei-traumatisoituneissa hermoissa (SEXI)

Tutkimukseen osallistuvat henkilöt, joille on suunniteltu lopullinen amputaatiotarkistus ja sulkeminen. Tutkimukseen osallistujan suunnitellun amputaatiotarkistuksen päivänä tutkimushenkilöstö on yhteydessä kirurgiseen henkilökuntaan koordinoidakseen hermonäytteiden ottamista. Jos potilaalle tehdään polven yläpuolinen amputaatio, otetaan iskiashermonäyte, jos potilaalle tehdään polven alapuolinen tai polviamputaatio, otetaan säärihermonäyte (iskiashermon pääkomponentti sen jälkeen, kun se jakautuu sääri- ja peroneaalisiin hermoihin polven polvitaipeen kuoppassa). Kirurgi sijoittaa ompeleen näytteen proksimaaliseen päähän osoittaakseen hermon ei-traumaattisen pään sekä antaa arvion näytteen otetun hermon pituussuuntaisesta sijainnista (ts. 10 cm distaalisesti polvinivellinjasta, 15 cm proksimaalisesti polvesta polvinivelen tasolla). Jokainen näyte leikataan samalla tavalla - skalpellilla. Kun kirurgi on leikannut kudoksen, se asetetaan muoviseen koeputkeen, joka on merkitty koehenkilön tutkimustunnistenumerolla (liitteellä "A" tai "B", jos kyseisestä koehenkilöstä otetaan kaksi näytettä), siirretään tutkimushenkilöstön jäsenelle ja jäädytetään välittömästi nestetypessä. Pakastettu näyte toimitetaan sitten tutkimusohjelmien laitoksen laboratorioon, jossa se säilytetään -80 °C:ssa ennen analysointia. Promiksaali-, keski- ja distaaliset näytteet otetaan DRP-laboratoriossa ja loput hermosegmentit korvataan -80-pakastimessa tulevaa analyysiä varten. Näytteet lähetetään sitten Duken yliopistoon käsittelyä ja analysointia varten suojatun lentopostin välityksellä. Duken yliopiston kollegat suorittavat näytteiden käsittelyn välittömästi ennen massaspektroskopiaanalyysiä. Yhteistyökumppanin tohtori Moseleyn laboratoriotehtäviin kuuluu sekä proteiinien uuttaminen että määritys. Uutojen määrä näytettä kohti vaihtelee sen pituuden mukaan, 2:sta noin 50:een. Yhteistyökumppanin tohtori Van de venin laboratoriotehtäviin kuuluvat näytteen käsittely, patologinen tutkimus, ohuiden viipaleiden poistaminen histologista tutkimusta varten ja segmenttien homogenointi RNA:n, DNA:n ja proteiinien uuttamista varten.

Yksittäiset segmentit sulatetaan jäillä ja homogenoidaan välittömästi sulatuksen jälkeen. Homogenointimenetelmät optimoidaan tuottamaan korkeimman liuenneen proteiinipitoisuuden. Testattavia menetelmiä ovat ultraäänikäsittely, mekaaninen hajottaminen laboratoriosekoittimella, mekaaninen hajottaminen manuaalisella pilkkomalla ja sen jälkeen Potter-laitteella ja pakastesulatus.

Kokettavia puskuri- ja liuotinsysteemimuuttujia ovat suolapitoisuus, pH ja puskurin tyyppi, kaotrooppinen konsentraatio (urea ja tiourea), orgaanisten oheisliuottimien, kuten DMSO, läsnäolo ja ionittoman pesuaineen läsnäolo. Kaikki homogenointi suoritetaan 0 - 4 °C:ssa ja proteaasi-inhibiittoreiden läsnä ollessa.

Proteomisessa analyysissä käytetään korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa/sähkösumutusmassaspektrometriaa täydentävänä reittinä proteiinien ilmentymisen erojen löytämiseksi terveen ja traumatisoituneen kudoksen välillä. Liukoisten ja solubilisoitujen proteiinien kiinteän faasin uuton jälkeen optimoimme olosuhteet UV-absorbanssin ja/tai kokonaisionivirran avulla havaittujen proteiinihuippujen erottamiseksi ja voimme käyttää useampaa kuin yhtä olosuhteita keskittyäksemme erilaisiin uutettujen proteiinien sarjoihin. Käytämme korkeahuokoisia C-18-käänteisfaasipylväitä sytosolisten proteiinien erottamiseen ja C-4:ää kalvoproteiineihin. Käytetään standardeja ionisaatio-, fragmentointi- ja detektiomenetelmiä, jotka ovat yhdenmukaisia ​​Research Operations Servicen (ROS) Shimadzu LCMS-IT-TOF -massaspektrometrin kanssa.

RNA-analyysiä varten uutettu RNA tuodaan Duke Center for Genomic and Computational Biology Genomic Technologies -ytimeen. Siellä RNA:n laatu määritetään käyttämällä Agilent 2100 bioanalyzer -laitetta ja sen jälkeen Affymetrix GeneChip -analyysiä. David Corcoran, biostatistikko, joka työskentelee Duke Center for Genomic and Computational Biologyssa, suorittaa data-analyysin.

Tässä tutkimuksessa hoitotasoon ei tehdä muutoksia. Iskiashermonäytteet muutoin hylättäisiin ihmiskudoksina; muita näitä näytteitä käyttäviä tutkimuksia ei ole meneillään.

Iskiashermon analyysin jälkeen keräämme tietoja – demografisia, vammoja ja kivunhoitotietoja sekä ennen leikkausta saatuja kipupisteitä – koehenkilöiden kaavioista toissijaisten tulosmuuttujien määrittämiseksi. (Katso Liite B – Tapausraporttilomakkeet)