SEXI: Expressão Ciática e Identificação de Proteínas Diferenciais em Nervos Traumatizados Versus Não Traumatizados (SEXI)

Indivíduos agendados para revisão final de amputação e encerramento(ões) serão abordados para participar do estudo. No dia da revisão de amputação planejada do participante do estudo, a equipe de pesquisa entrará em contato com a equipe cirúrgica para coordenar a coleta de espécimes de nervo. Se um paciente tiver uma amputação acima do joelho, uma amostra do nervo ciático será obtida, se um paciente tiver uma amputação abaixo do joelho ou através de amputação do joelho, uma amostra do nervo tibial será obtida (o principal componente do nervo ciático após se dividir nos nervos tibial e fibular na fossa poplítea do joelho). O cirurgião colocará uma sutura na extremidade proximal do espécime para indicar a extremidade não traumatizada do nervo, bem como fornecer uma estimativa da localização longitudinal do nervo amostrado (ou seja, 10 cm distal à linha da articulação do joelho, 15 cm proximal ao joelho ao nível da articulação do joelho). Cada amostra será excisada da mesma maneira - usando um bisturi. Uma vez que o tecido é excisado pelo cirurgião, ele será colocado em um tubo de ensaio de plástico rotulado com o número de identificação do estudo dos sujeitos (com o sufixo "A" ou "B" se duas amostras estiverem sendo retiradas desse sujeito), transferido para um membro da equipe de pesquisa e imediatamente congelado em nitrogênio líquido. A amostra congelada será então entregue ao laboratório do Departamento de Programas de Pesquisa, onde será armazenada a -80°C antes da análise. As amostras promixal, média e distal serão obtidas no laboratório DRP e os segmentos restantes do nervo serão recolocados no freezer -80 para análise futura. As amostras serão enviadas para a Duke University para processamento e análise por meio de uma transportadora aérea segura. A tarefa de processamento de amostras será realizada imediatamente antes da análise por espectroscopia de massa por colegas da Duke University. As responsabilidades de laboratório do colaborador Dr. Moseley incluem extração e análise de proteínas. O número de extrações por amostra irá variar dependendo do seu comprimento, de 2 a cerca de 50. As responsabilidades laboratoriais do colaborador Dr. Van de ven incluem manuseio de amostras, exame patológico, remoção de fatias finas para exame histológico e homogeneização de segmentos para extração de RNA, DNA e proteínas.

Segmentos individuais serão descongelados em gelo e homogeneizados imediatamente após o descongelamento. Os métodos de homogeneização serão otimizados para produzir o maior teor de proteína dissolvida. Os métodos a serem testados incluirão sonicação, interrupção mecânica por liquidificador de laboratório, interrupção mecânica por corte manual seguido pelo dispositivo Potter e descongelamento por congelamento.

As variáveis ​​do sistema tampão e solvente a serem testadas incluem concentração de sal, pH e tipo de tampão, concentração caotrópica (ureia e tioureia), presença de co-solventes orgânicos, como DMSO, e presença de detergente não iônico. Toda a homogeneização será realizada entre 0 e 4°C e na presença de inibidores de protease.

Para análise proteômica, cromatografia líquida de alta eficiência/espectrometria de massa por eletrospray será empregada como rota complementar para descobrir diferenças na expressão de proteínas entre tecidos saudáveis ​​e traumatizados. Após a extração em fase sólida de proteínas solúveis e solubilizadas, otimizaremos as condições para separação de picos de proteínas detectados por absorção de UV e/ou corrente iônica total e podemos empregar mais de um conjunto de condições para focar em diferentes conjuntos de proteínas extraídas. Usaremos colunas de fase reversa C-18 de alta porosidade para separar proteínas citosólicas e C-4 para proteínas de membrana. Serão usados ​​métodos padrão de ionização, fragmentação e detecção consistentes com o espectrômetro de massa Shimadzu LCMS-IT-TOF no Serviço de Operações de Pesquisa (ROS).

Para análise de RNA, o RNA extraído será levado ao núcleo de Tecnologias Genômicas do Duke Center for Genomic and Computational Biology. Lá, a qualidade do RNA será determinada usando um Agilent 2100bioanalyzer seguido por análise Affymetrix GeneChip. David Corcoran, o bioestatístico que trabalha no Duke Center for Genomic and Computational Biology, fará a análise dos dados.

Neste estudo, nenhuma mudança no padrão de atendimento será implementada. Caso contrário, os espécimes do nervo ciático seriam descartados como tecido humano; não há outras investigações em andamento usando esses espécimes.

Após a análise do nervo ciático, coletaremos dados - informações demográficas, de lesões e de tratamento da dor, bem como pontuações de dor pré-operatória - dos prontuários dos indivíduos para determinar as variáveis ​​de resultado secundárias. (Consulte o Apêndice B - Formulários de Relato de Caso)