歯周治療後の喫煙者と非喫煙者における歯周病病原体の臨床状態と有病率

60 人の患者 (30 人の喫煙者 (SM) と 30 人の非喫煙者 (NS) がこの研究に参加するために選択されます。 すべての被験者は、ブラジル、リオデジャネイロ州ノバフリブルゴにあるフルミネンセ連邦大学歯学部の歯周病学科から募集されます。 研究プロトコルは、フルミネンセ連邦大学医学部の倫理委員会によって承認されました (プロトコル番号: CAAE - 0070.0.258.000-10)。 参加前に、目的と手順がすべての患者に十分に説明され、その結果、ヘルシンキ宣言に従って書面によるインフォームド コンセントが得られます。 病歴および歯の病歴が記録され、患者は事前スクリーニングの来院時に臨床評価を受けます。

臨床検査、微生物収集および歯周治療 以前の臨床検査、葉巻の消費年数および毎日の消費量に関する情報を記録して、研究の喫煙者および非喫煙者の被験者を選択します。 経験豊富な歯周病専門医が、プロトコル手順のために歯の臨床歯周パラメーターを実行します。 選択された各選択された歯は、歯周プローブ PCP15 (PCP-UNC15 、Hu-Friedy、シカゴ、イリノイ州)、6 つの部位 (近頬側、中頬側、遠心頬側、近位舌側、中舌側、離舌側) が記録されます。 プロービング深度 (PPD) > 5mm のサイトが微生物学的分析のために選択されます。 臨床測定の後、歯肉縁上のバイオフィルムは滅菌ガーゼで除去されます。 歯肉溝のサンプルは、各患者の最も深い PPD (>5mm) を持つ 4 つの部位から、最も深いポケットから 30 秒間滅菌紙ポイントを使用して採取されます。 プールされた各部位からのバイオフィルムは、Tris-EDTA緩衝液(10 mM Tris-Hcl、0.1 mM EDTA、pH 7.5)を含む2つのマイクロチューブに分離され、-20°Cで保存されました。 サンプルは、ポリメラーゼ連鎖反応 - PCR によって微生物学的に分析されます。 歯周治療は、スケーリングと根の計画で構成され、最初の月に4回、その後は月に1回、1年間完了します。 患者は臨床的に評価され、歯周治療のベースライン、3か月、6か月、および1年後に微生物学的収集が行われます。

微生物学的評価 - PCR アッセイ DNA を抽出し、分光光度計で 260 nm (Genesys 10UV、Rochester、NY、USA) で定量化し、100 ng/mL の標準濃度を取得し、その後の PCR のために -20 °C で保存します。反応。 簡単に説明すると、サンプルを溶解溶液 (抽出バッファーとプロテイナーゼ K) に入れ、クロロホルム: イソアミルアルコールを使用して精製し、続いてイソプロパノールと 70% エタノールで DNA 沈殿を行います。 DNA を TE バッファー (10 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA、pH 7.5、10 μg/mL RNAse を含む) に再懸濁します。 微生物の分子同定は、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythia、Prevotella intermedia、Campylobacter rectus、Candida albicans、Candida glabrata、Candida tropicalis、およびCandida dubliniensesに特異的なプライマーを使用した PCR によって実行されます。 ＰＣＲ増幅は、プライマーの各対に特異的な熱条件下で、ＴＧｒａｄｉｅｎｔ ９６（Ｂｉｏｍｅｔｒａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に対してＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム２４００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施される。 PCR産物は、2%アガロースゲルおよびTris-borate-EDTAランニングバッファー(pH 8.0)での電気泳動によって分離されます。 分子量ラダー (100 bp DNA ラダー、Gibco、Grand Island、NY、USA) は、アガロースゲルで実行するために含まれます。 DNA は 0.1µl の Sybr Safe/mL (Invitrogen、CA、USA) で染色され、UV 照明 (Pharmacia LKB-MacroVue、San Gabriel、CA、USA) で視覚化されます。 画像の写真が撮影され (Image Mater - LISCAP、VDS、Pharmacia Biotech Piscataway、NJ、USA)、分析されます。