牙周病治疗后吸烟者和非吸烟者的临床情况和牙周病原体流行情况

将选择 60 名患者（30 名吸烟者 (SM) 和 30 名非吸烟者 (NS)）参与这项研究。 所有受试者将从巴西里约热内卢州 Nova Friburgo 的 Fluminense 联邦大学牙科学院牙周病学系招募。 弗鲁米嫩塞联邦大学医学院伦理委员会批准了研究方案（方案编号：CAAE - 0070.0.258.000-10）。 在参与之前，将向所有患者充分解释目的和程序，他们随后根据赫尔辛基宣言给予书面知情同意。 将记录病史和牙科病史，患者将在预筛查访视时接受临床评估。

临床检查、微生物收集和牙周治疗 将记录以前的临床检查、有关雪茄消费年限和每日消费量的信息，以选择吸烟者和非吸烟者受试者进行研究。 经验丰富的牙周病医生将针对协议程序对牙齿进行临床牙周参数检查。 将测量所选的每颗牙齿：使用牙周探针 PCP15 (PCP-UNC15) 进行牙菌斑指数 (PI)、探针出血 (BOP)、牙周袋探诊深度 (PPD)、牙龈退缩 (GR)、临床附着水平 (CAL) , Hu-Friedy, Chicago, IL), 六个位点（近颊、中颊、远颊、近中舌、中舌、远舌）将被记录。 将选择探测深度 (PPD) > 5mm 的位点进行微生物分析。 临床测量后，将用无菌纱布去除龈上生物膜。 使用无菌纸尖从最深的口袋中取出 30 秒，从每位患者 PPD 最深（> 5 毫米）的 4 个部位采集牙龈沟样本。 来自每个站点的汇集生物膜将在两个含有 Tris -EDTA 缓冲液（10 mM Tris-Hcl、0.1 mM EDTA，pH 7.5）的微管中分离，并储存在 -20°C 下。 样品将通过聚合酶链反应 - PCR 进行微生物学分析。 牙周治疗包括洗牙和刨根，第一个月4次，之后每月1次，直至完成1年。 将对患者进行临床评估，并在基线、牙周治疗后 3 个月、6 个月和 1 年收集微生物。

微生物评估 - PCR 检测 DNA 将在 260 nm 的分光光度计（Genesys 10UV，Rochester，NY，USA）中提取和定量，以获得 100 ng/mL 的标准浓度，并储存在 -20 °C 下用于后续 PCR反应。 简而言之，将样品置于酶溶液（提取缓冲液和蛋白酶 K）中，然后使用氯仿：异戊醇纯化，然后用异丙醇和 70% 乙醇进行 DNA 沉淀。 将 DNA 重悬于 TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，pH 7.5，含 10 μg/mL RNAse）中。 微生物分子鉴定将通过 PCR 进行，使用特定引物对 Aggregatibacter actinomycetemcomitans、牙龈卟啉单胞菌、Tannerella forsythia、Prevotella intermedia、直弯曲杆菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌和都柏林念珠菌。 将在每对引物特异的热条件下，使用用于 TGradient 96（Biometra，德国）的 GeneAmp PCR 系统 2400（Perkin-Elmer - Applied Biosystems）进行 PCR 扩增。 PCR 产物将在 2% 琼脂糖凝胶和 Tris-borate-EDTA 电泳缓冲液 (pH 8.0) 中通过电泳分离。 分子量阶梯（100 bp DNA 阶梯，Gibco，Grand Island，NY，USA）将包含在琼脂糖凝胶中运行。 DNA 将用 0.1µl Sybr Safe/mL（Invitrogen，CA，USA）染色，并在紫外线照射下（Pharmacia LKB-MacroVue，San Gabriel，CA，USA）可视化。 将拍摄图像照片（Image Mater - LISCAP，VDS，Pharmacia Biotech Piscataway，NJ，USA）并进行分析。