Uwarunkowania kliniczne i rozpowszechnienie patogenów przyzębia u osób palących i niepalących po leczeniu periodontologicznym

Sześćdziesięciu pacjentów (30 palaczy (SM) i 30 niepalących (NS) zostanie wybranych do udziału w tym badaniu. Wszyscy uczestnicy będą rekrutowani z Wydziału Periodontologii Szkoły Stomatologii Uniwersytetu Federalnego Fluminense w Nova Friburgo w stanie Rio de Janeiro w Brazylii. Protokół badania został zatwierdzony (numer protokołu: CAAE - 0070.0.258.000-10) przez Komisję Etyki School of Medicine, Fluminense Federal University. Przed uczestnictwem cel i procedury zostaną w pełni wyjaśnione wszystkim pacjentom, którzy w konsekwencji wyrazili pisemną świadomą zgodę zgodnie z Deklaracją Helsińską. Zostaną zebrane historie medyczne i dentystyczne, a pacjenci zostaną poddani ocenie klinicznej podczas wizyt wstępnych.

Badanie kliniczne, zbieranie mikrobiologiczne i terapia periodontologiczna Wcześniejsze badanie kliniczne, informacje o latach używania cygar i ilości dziennego spożycia zostaną odnotowane dla wybranych osób palących i niepalących do badania. Doświadczony periodontolog wykona kliniczne parametry periodontologiczne w zębach do zabiegu protokolarnego. Każdy wybrany ząb zostanie zmierzony pod kątem: wskaźnika płytki nazębnej (PI), krwawienia na sondzie (BOP), głębokości sondowania kieszonki (PPD), recesji dziąsła (GR), poziomu przyczepu klinicznego (CAL) za pomocą sondy periodontologicznej PCP15 (PCP-UNC15) , Hu-Friedy, Chicago, IL), zostanie zarejestrowanych sześć miejsc (mezja policzkowa, przyśrodkowa, dystopoliczkowa, mezjalno-językowa, przyśrodkowo-językowa, dysto-językowa). Miejsca o głębokości sondowania (PPD) > 5 mm zostaną wybrane do analizy mikrobiologicznej. Po pomiarach klinicznych biofilm naddziąsłowy zostanie usunięty sterylną gazą. Próbki dziąseł będą pobierane z 4 miejsc z najgłębszym PPD (>5 mm) u każdego pacjenta za pomocą sterylnego papierowego sączka z najgłębszej kieszeni przez 30 sekund. Połączone biofilmy z każdego miejsca zostaną rozdzielone w dwóch mikroprobówkach zawierających bufor Tris-EDTA (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,5) i były przechowywane w temperaturze -20°C. Próbki zostaną poddane analizie mikrobiologicznej metodą łańcuchowej reakcji polimerazy - PCR. Leczenie periodontologiczne będzie polegało na skalingu i planowaniu korzeni, 4 razy w pierwszym miesiącu, a następnie raz w miesiącu do ukończenia 1 roku. Pacjenci zostaną poddani ocenie klinicznej i zostaną wykonane badania mikrobiologiczne na początku badania, 3 miesiące, 6 miesięcy i 1 rok po leczeniu periodontologicznym.

Ocena mikrobiologiczna – testy PCR DNA będzie ekstrahowane i oznaczane ilościowo w spektrofotometrze przy 260 nm (Genesys 10UV, Rochester, NY, USA), w celu uzyskania standardowego stężenia 100 ng/mL i przechowywane w temperaturze -20°C do późniejszego PCR reakcje. Pokrótce, próbki zostaną umieszczone w roztworze lizy (bufor do ekstrakcji i proteinaza K), a następnie oczyszczone przy użyciu chloroformu:alkoholu izoamilowego, a następnie wytrącone DNA izopropanolem i 70% etanolem. DNA zostanie ponownie zawieszone w buforze TE (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,5, z 10 μg/ml RNAzy). Identyfikacja molekularna drobnoustrojów zostanie przeprowadzona metodą PCR ze specyficznymi starterami dla Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Prevotella intermedia, Campylobacter rectus, Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis i Candida dublinienses. Amplifikacja PCR zostanie przeprowadzona z użyciem systemu GeneAmp PCR 2400 (Perkin-Elmer - Applied Biosystems) dla TGradient 96 (Biometra, Niemcy) w warunkach termicznych właściwych dla każdej pary starterów. Produkty PCR zostaną rozdzielone za pomocą elektroforezy w 2% żelach agarozowych i buforze roboczym Tris-boran-EDTA (pH 8,0). Drabina masy cząsteczkowej (drabina DNA 100 bp, Gibco, Grand Island, NY, USA) zostanie dołączona do analizy w żelu agarozowym. DNA będzie barwione 0,1 µl Sybr Safe/ml (Invitrogen, CA, USA) i wizualizowane w świetle UV (Pharmacia LKB-MacroVue, San Gabriel, CA, USA). Zdjęcia obrazów zostaną wykonane (Image Mater - LISCAP, VDS, Pharmacia Biotech Piscataway, NJ, USA) i przeanalizowane.