Klinické stavy a prevalence parodontopatogenů u kuřáků a nekuřáků po parodontální terapii

K účasti na této studii bude vybráno 60 pacientů (30 kuřáků (SM) a 30 nekuřáků (NS). Všechny subjekty budou rekrutovány z katedry parodontologie, School of Dentistry, Fluminense Federal University, Nova Friburgo, stát Rio de Janeiro, Brazílie. Protokol studie byl schválen (číslo protokolu: CAAE - 0070.0.258.000-10) Etickou komisí Lékařské fakulty, Fluminense Federal University. Před účastí bude účel a postupy plně vysvětleny všem pacientům, kteří následně dali písemný informovaný souhlas v souladu s Helsinskou deklarací. Bude odebrána lékařská a zubní anamnéza a pacienti obdrží klinické hodnocení při předběžných návštěvách.

Klinické vyšetření, mikrobiologické odběry a parodontologická terapie Předchozí klinické vyšetření, informace o letech spotřeby doutníků a množství denní spotřeby budou zaznamenávány vybraným kuřákům a nekuřákům do studie. Zkušený parodontolog provede klinické parodontální parametry zubů pro protokolární postup. Každý vybraný zub bude měřen na: index plaku (PI), krvácení na sondě (BOP), hloubku sondování v kapse (PPD), gingivální recesi (GR), úroveň klinického připojení (CAL) pomocí periodontální sondy PCP15 (PCP-UNC15 , Hu-Friedy, Chicago, IL), bude zaznamenáno šest lokalit (mezio-bukální, mediobukální, disto-bukální, mesio-lingvální, medio-lingvální, disto-lingvální). Pro mikrobiologickou analýzu budou vybrána místa s hloubkou sondy (PPD) > 5 mm. Po klinických měřeních bude supragingivální biofilm odstraněn sterilní gázou. Vzorky gingivální štěrbiny budou odebrány ze 4 míst s nejhlubší PPD (>5 mm) u každého pacienta pomocí sterilního papírového hrotu z nejhlubší kapsy po dobu 30 s. Spojené biofilmy z každého místa se oddělí ve dvou mikrozkumavkách obsahujících pufr Tris-EDTA (10 mM Tris-Hcl, 0,1 mM EDTA, pH 7,5) a skladují se při -20 °C. Vzorky budou mikrobiologicky analyzovány polymerázovou řetězovou reakcí - PCR. Parodontální ošetření bude sestávat ze škálování a plánování kořene, 4x v prvním měsíci a poté 1x měsíčně až do úplného 1 roku. Pacienti budou klinicky hodnoceni a mikrobiologické odběry budou provedeny na začátku, 3 měsíce, 6 měsíců a 1 rok po periodontální léčbě.

Mikrobiologické hodnocení - PCR testy DNA bude extrahována a kvantifikována ve spektrofotometru při 260 nm (Genesys 10UV, Rochester, NY, USA), aby se získala standardní koncentrace 100 ng/ml a skladována při -20 °C pro následnou PCR reakce. Stručně řečeno, vzorky budou podrobeny roztoku lise (extrakční pufr a proteináza K) a poté purifikovány pomocí chloroform:isoamil-alkohol, následuje precipitace DNA isopropanolem a 70% ethanolem. DNA bude resuspendována v TE pufru (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,5, s 10 ug/ml RNázy). Mikrobiální molekulární identifikace bude provedena pomocí PCR se specifickými primery pro Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Prevotella intermedia, Campylobacter rectus, Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis a Candida dublinienses. PCR amplifikace bude provedena pomocí GeneAmp PCR systému 2400 (Perkin-Elmer - Applied Biosystems) pro TGradient 96 (Biometra, Německo) za tepelných podmínek specifických pro každý pár primerů. Produkty PCR budou separovány elektroforézou ve 2% agarózových gelech a pufru Tris-borate-EDTA (pH 8,0). Žebřík molekulové hmotnosti (100 bp DNA žebřík, Gibco, Grand Island, NY, USA) bude zahrnut pro běh v agarózovém gelu. DNA bude obarvena 0,1 µl Sybr Safe/ml (Invitrogen, CA, USA) a vizualizována pod UV osvětlením (Pharmacia LKB-MacroVue, San Gabriel, CA, USA). Budou pořízeny fotografie snímků (Image Mater - LISCAP, VDS, Pharmacia Biotech Piscataway, NJ, USA) a analyzovány.