Periodontopatogeenien kliiniset sairaudet ja esiintyvyys tupakoitsijoilla ja tupakoimattomilla parodontaalihoidon jälkeen

Kuusikymmentä potilasta (30 tupakoitsijaa (SM) ja 30 tupakoimatonta (NS) valitaan osallistumaan tähän tutkimukseen. Kaikki aineet rekrytoidaan parodontologian laitokselta, Hammaslääketieteen koulusta, Fluminensen liittovaltion yliopistosta, Nova Friburgosta, Rio de Janeiron osavaltiosta, Brasiliasta. Tutkimusprotokollan hyväksyi (protokollan numero: CAAE - 0070.0.258.000-10) Fluminensen liittovaltion yliopiston lääketieteellisen korkeakoulun eettinen komitea. Ennen osallistumista kaikille potilaille, jotka ovat antaneet kirjallisen tietoisen suostumuksensa Helsingin julistuksen mukaisesti, selitetään perusteellisesti tarkoitus ja menettelytavat. Sairaus- ja hammashistoria otetaan ja potilaat saavat kliinisen arvioinnin esiseulontakäynneillä.

Kliiniset tutkimukset, mikrobiologiset keräykset ja periodontaalinen hoito Aiempi kliininen tutkimus, tiedot sikarien käyttövuosista ja päivittäisen kulutuksen määrästä kirjataan tutkimukseen valituille tupakoiville ja tupakoimattomille. Kokenut parodontologi tekee kliiniset parodontaaliparametrit hampaille protokollamenettelyä varten. Jokaisesta valitusta hampaasta mitataan: plakkiindeksi (PI), verenvuoto koettimella (BOP), taskukoetussyvyys (PPD), ienvauma (GR), kliinisen kiinnittymisen taso (CAL) käyttäen parodontaalista PCP15-anturia (PCP-UNC15). , Hu-Friedy, Chicago, IL), kuusi paikkaa (mesio-buccal, mediobuccal, disto-buccal, mesio-lingual, medio-lingual, disto-lingual) tallennetaan. Mikrobiologiseen analyysiin valitaan paikat, joiden mittaussyvyys (PPD) > 5 mm. Kliinisten mittausten jälkeen supragingivaalinen biofilmi poistetaan steriilillä sideharsolla. Gingival crevicular -näytteet otetaan 4 kohdasta, joissa on syvimmällä taskulla (> 5 mm) jokaisella potilaalla steriiliä paperipistettä 30 sekunnin ajan. Yhdistetyt biofilmit kustakin paikasta erotetaan kahdessa mikroputkessa, jotka sisältävät Tris-EDTA-puskuria (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,5), ja niitä säilytettiin -20 °C:ssa. Näytteet analysoidaan mikrobiologisesti Polymerase Chain Reaction - PCR:llä. Parodontaalihoito koostuu skaalaus- ja juurijuuren suunnittelusta 4 kertaa ensimmäisen kuukauden aikana ja sen jälkeen kerran kuukaudessa vuoden loppuun asti. Potilaat arvioidaan kliinisesti ja mikrobiologiset keräykset tehdään lähtötilanteessa, 3 kuukautta, 6 kuukautta ja 1 vuosi parodontaalihoidon jälkeen.

Mikrobiologinen arviointi - PCR-määritykset DNA uutetaan ja kvantifioidaan spektrofotometrillä 260 nm:ssä (Genesys 10UV, Rochester, NY, USA), jotta saadaan standardipitoisuus 100 ng/ml ja säilytetään -20 °C:ssa myöhempää PCR:ää varten. reaktiot. Lyhyesti sanottuna näytteet saatetaan lise-liuokseen (uuttopuskuri ja proteinaasi K) ja puhdistetaan sitten käyttämällä kloroformi:isoamiili-alkoholia, minkä jälkeen DNA saostetaan isopropanolilla ja 70 % etanolilla. DNA suspensoidaan uudelleen TE-puskuriin (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,5, 10 µg/ml RNAasia). Mikrobimolekyylitunnistus suoritetaan PCR:llä erityisillä alukkeilla Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Prevotella intermedia, Campylobacter rectus, Candida albicans, Candida glabrata, Candida dubliniens ja Candida. PCR-monistus suoritetaan GeneAmp PCR-järjestelmällä 2400 (Perkin-Elmer - Applied Biosystems) TGradient 96:lle (Biometra, Saksa) kullekin alukeparille spesifisissä lämpöolosuhteissa. PCR-tuotteet erotetaan elektroforeesilla 2-prosenttisissa agaroosigeeleissä ja Tris-boraatti-EDTA-ajopuskurissa (pH 8,0). Molekyylimassatikkaat (100 bp DNA-ladder, Gibco, Grand Island, NY, USA) sisällytetään agaroosigeelissä ajamista varten. DNA värjätään 0,1 ul:lla Sybr Safe/ml (Invitrogen, CA, USA) ja visualisoidaan UV-valossa (Pharmacia LKB-MacroVue, San Gabriel, CA, USA). Kuvista otetaan valokuvat (Image Mater - LISCAP, VDS, Pharmacia Biotech Piscataway, NJ, USA) ja analysoidaan.