Condições clínicas e prevalência de periodontopatógenos em fumantes e não fumantes após tratamento periodontal

Sessenta pacientes (30 fumantes (SM) e 30 não fumantes (NS) serão selecionados para participar deste estudo. Todos os indivíduos serão recrutados no Departamento de Periodontologia da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense, Nova Friburgo, Estado do Rio de Janeiro, Brasil. O protocolo do estudo foi aprovado (número do protocolo: CAAE - 0070.0.258.000-10) pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade Federal Fluminense. Antes da participação, o objetivo e os procedimentos serão totalmente explicados a todos os pacientes, que conseqüentemente deram consentimento informado por escrito de acordo com a Declaração de Helsinque. Os históricos médico e odontológico serão coletados e os pacientes receberão avaliação clínica nas visitas de pré-triagem.

Exame clínico, coletas microbiológicas e terapia periodontal Exame clínico prévio, informações sobre anos de consumo de charutos e quantidade de consumo diário serão registrados para selecionar indivíduos fumantes e não fumantes para o estudo. Um periodontista experiente realizará parâmetros periodontais clínicos nos dentes para o procedimento de protocolo. Cada dente selecionado será medido para: Índice de Placa (PI), Sangramento na Sonda (BOP), Profundidade de Sondagem de Bolso (PPD), Recessão Gengival (GR), Nível de Inclusão Clínica (CAL) usando uma sonda periodontal PCP15 (PCP-UNC15 , Hu-Friedy, Chicago, IL), seis locais (mésio-vestibular, medio-vestibular, disto-vestibular, mésio-lingual, médio-lingual, disto-lingual) serão registrados. Locais com profundidade de sondagem (PPD) > 5mm serão selecionados para análise microbiológica. Após as medidas clínicas, o biofilme supragengival será removido com gaze estéril. Amostras creviculares gengivais serão retiradas de 4 locais com o PPD mais profundo (>5mm) em cada paciente usando uma ponta de papel estéril do bolso mais profundo por 30s. Biofilmes agrupados de cada sítio serão separados em dois microtubos contendo tampão Tris-EDTA (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,5) e armazenados a -20°C. As amostras serão analisadas microbiologicamente pela Reação em Cadeia da Polimerase - PCR. O tratamento periodontal consistirá em raspagem e alisamento radicular, 4 vezes no primeiro mês e depois uma vez por mês até completar 1 ano. Os pacientes serão avaliados clinicamente e coletas microbiológicas serão feitas no início, 3 meses, 6 meses e 1 ano após o tratamento periodontal.

Avaliação microbiológica - Ensaios de PCR O DNA será extraído e quantificado em espectrofotômetro a 260 nm (Genesys 10UV, Rochester, NY, EUA), a fim de obter uma concentração padrão de 100 ng/mL e armazenado a -20 °C para posterior PCR reações. Resumidamente, as amostras serão submetidas a uma solução de lise (tampão de extração e proteinase K) e então purificadas usando clorofórmio:álcool isoamílico, seguida de precipitação do DNA com isopropanol e etanol 70%. O DNA será ressuspenso em tampão TE (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,5, com 10 μg/mL de RNAse). A identificação molecular microbiana será realizada por PCR com primers específicos para Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Prevotella intermedia, Campylobacter rectus, Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis e Candida dublinienses. A amplificação por PCR será realizada com sistema GeneAmp PCR 2400 (Perkin-Elmer - Applied Biosystems) para TGradient 96 (Biometra, Germany) sob condições térmicas específicas para cada par de primers. Os produtos da PCR serão separados por eletroforese em géis de agarose 2% e tampão de corrida Tris-borato-EDTA (pH 8,0). A escada de massa molecular (100 pb DNA ladder, Gibco, Grand Island, NY, EUA) será incluída para corrida no gel de agarose. O DNA será corado com 0,1µl de Sybr Safe/mL (Invitrogen, CA, USA) e visualizado sob iluminação UV (Pharmacia LKB-MacroVue, San Gabriel, CA, USA). Fotografias das imagens serão tiradas (Image Mater - LISCAP, VDS, Pharmacia Biotech Piscataway, NJ, USA) e analisadas.