Klinische Zustände und Prävalenz von Parodontopathogenen bei Rauchern und Nichtrauchern nach Parodontaltherapie

Sechzig Patienten (30 Raucher (SM) und 30 Nichtraucher (NS) werden für die Teilnahme an dieser Studie ausgewählt. Alle Probanden werden von der Abteilung für Parodontologie, School of Dentistry, Fluminense Federal University, Nova Friburgo, Bundesstaat Rio de Janeiro, Brasilien, rekrutiert. Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der School of Medicine der Fluminense Federal University genehmigt (Protokollnummer: CAAE - 0070.0.258.000-10). Vor der Teilnahme werden der Zweck und die Verfahren allen Patienten vollständig erklärt, die daraufhin eine schriftliche Einverständniserklärung gemäß der Deklaration von Helsinki abgegeben haben. Bei Voruntersuchungen werden medizinische und zahnärztliche Anamnese erhoben und die Patienten klinisch untersucht.

Klinische Untersuchung, mikrobiologische Erhebungen und Parodontaltherapie Bei ausgewählten Rauchern und Nichtrauchern werden für die Studie frühere klinische Untersuchungen, Informationen über Jahre des Zigarrenkonsums und die Menge des täglichen Konsums erfasst. Ein erfahrener Parodontologe führt für das Protokollverfahren klinische parodontale Parameter an den Zähnen durch. Jeder ausgewählte Zahn wird gemessen auf: Plaque-Index (PI), Blutung auf der Sonde (BOP), Taschensondierungstiefe (PPD), Gingivarezession (GR), klinisches Attachmentlevel (CAL) mit einer Parodontalsonde PCP15 (PCP-UNC15 , Hu-Friedy, Chicago, IL), werden sechs Standorte (mesio-bukkale, medio-bukkale, disto-bukkale, mesio-linguale, medio-linguale, disto-linguale) aufgezeichnet. Stellen mit einer Sondierungstiefe (PPD) > 5 mm werden für die mikrobiologische Analyse ausgewählt. Nach klinischen Messungen wird der supragingivale Biofilm mit steriler Gaze entfernt. Zahnfleischtaschenproben werden von 4 Stellen mit der tiefsten PPD (> 5 mm) bei jedem Patienten entnommen, wobei eine sterile Papierspitze aus der tiefsten Tasche für 30 Sekunden verwendet wird. Gepoolte Biofilme von jeder Stelle werden in zwei Mikroröhrchen getrennt, die Tris-EDTA-Puffer (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,5) enthalten, und wurden bei –20°C gelagert. Die Proben werden mikrobiologisch mittels Polymerase Chain Reaction - PCR analysiert. Die parodontale Behandlung besteht aus Scaling und Planung der Wurzel, 4 Mal im ersten Monat und danach einmal im Monat bis zum Ende des 1 Jahres. Die Patienten werden klinisch untersucht und mikrobiologische Erhebungen werden zu Studienbeginn, 3 Monate, 6 Monate und 1 Jahr nach der Parodontalbehandlung durchgeführt.

Mikrobiologische Bewertung – PCR-Assays DNA wird extrahiert und in einem Spektrophotometer bei 260 nm (Genesys 10UV, Rochester, NY, USA) quantifiziert, um eine Standardkonzentration von 100 ng/ml zu erhalten, und für die nachfolgende PCR bei -20 °C gelagert Reaktionen. Kurz gesagt werden die Proben einer Lise-Lösung (Extraktionspuffer und Proteinase K) unterzogen und dann unter Verwendung von Chloroform:Isomilch-Alkohol gereinigt, gefolgt von einer DNA-Präzipitation mit Isopropanol und 70 % Ethanol. Die DNA wird in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,5, mit 10 μg/ml RNAse) resuspendiert. Die mikrobielle molekulare Identifizierung erfolgt durch PCR mit spezifischen Primern für Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Prevotella intermedia, Campylobacter rectus, Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis und Candida dublinienses. Die PCR-Amplifikation wird mit einem GeneAmp-PCR-System 2400 (Perkin-Elmer – Applied Biosystems) für TGradient 96 (Biometra, Deutschland) unter thermischen Bedingungen durchgeführt, die für jedes Primerpaar spezifisch sind. Die PCR-Produkte werden durch Elektrophorese in 2% Agarosegelen und Tris-Borat-EDTA-Laufpuffer (pH 8,0) aufgetrennt. Die Molekularmassenleiter (100-bp-DNA-Leiter, Gibco, Grand Island, NY, USA) wird zum Laufen im Agarosegel enthalten sein. Die DNA wird mit 0,1 µl Sybr Safe/ml (Invitrogen, CA, USA) gefärbt und unter UV-Beleuchtung (Pharmacia LKB-MacroVue, San Gabriel, CA, USA) sichtbar gemacht. Fotos der Bilder werden aufgenommen (Image Mater – LISCAP, VDS, Pharmacia Biotech Piscataway, NJ, USA) und analysiert.