Condiciones clínicas y prevalencia de periodontopatógenos en fumadores y no fumadores después de la terapia periodontal

Sesenta pacientes (30 fumadores (SM) y 30 no fumadores (NS) serán seleccionados para participar de este estudio. Todos los sujetos serán reclutados del Departamento de Periodoncia, Facultad de Odontología, Universidad Federal Fluminense, Nova Friburgo, Estado de Río de Janeiro, Brasil. El protocolo del estudio fue aprobado (número de protocolo: CAAE - 0070.0.258.000-10) por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad Federal Fluminense. Antes de la participación, el propósito y los procedimientos se explicarán completamente a todos los pacientes, quienes en consecuencia dieron su consentimiento informado por escrito de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Se tomarán las historias médicas y dentales y los pacientes recibirán una evaluación clínica en las visitas de preselección.

Examen clínico, colecta microbiológica y terapia periodontal Se registrará examen clínico previo, información sobre años de consumo de puros y cantidad de consumo diario para seleccionar sujetos fumadores y no fumadores para el estudio. Un periodoncista experimentado realizará los parámetros periodontales clínicos en los dientes para el procedimiento del protocolo. Cada diente seleccionado se medirá para: índice de placa (PI), sangrado en la sonda (BOP), profundidad de sondaje de bolsa (PPD), recesión gingival (GR), nivel de inserción clínica (CAL) usando una sonda periodontal PCP15 (PCP-UNC15 , Hu-Friedy, Chicago, IL), se registrarán seis sitios (mesiobucal, mediobucal, distobucal, mesiolingual, mediolingual, distolingual). Se seleccionarán sitios con profundidad de sondeo (PPD) > 5 mm para el análisis microbiológico. Después de las mediciones clínicas, la biopelícula supragingival se eliminará con una gasa estéril. Se tomarán muestras creviculares gingivales de 4 sitios con el PPD más profundo (>5 mm) en cada paciente utilizando una punta de papel estéril del bolsillo más profundo durante 30 s. Las biopelículas agrupadas de cada sitio se separarán en dos microtubos que contienen tampón Tris-EDTA (Tris-Hcl 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,5) y se almacenarán a -20 °C. Las muestras serán analizadas microbiológicamente por Reacción en Cadena de la Polimerasa - PCR. El tratamiento periodontal consistirá en raspado y alisado radicular, 4 veces en el primer mes y posteriormente una vez al mes hasta completar 1 año. Los pacientes serán evaluados clínicamente y se realizarán colectas microbiológicas al inicio, 3 meses, 6 meses y 1 año después del tratamiento periodontal.

Evaluación microbiológica - Ensayos PCR El ADN se extraerá y cuantificará en un espectrofotómetro a 260 nm (Genesys 10UV, Rochester, NY, EE. UU.), para obtener una concentración estándar de 100 ng/mL y se almacenará a -20 °C para su posterior PCR reacciones Brevemente, las muestras se someterán a una solución lisa (tampón de extracción y proteinasa K) y luego se purificarán con cloroformo: alcohol isoamílico, seguido de la precipitación del ADN con isopropanol y etanol al 70%. El ADN se resuspenderá en tampón TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,5, con 10 μg/ml de ARNasa). La identificación molecular microbiana se realizará mediante PCR con cebadores específicos para Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Prevotella intermedia, Campylobacter rectus, Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis y Candida dublinienses. La amplificación por PCR se realizará con un sistema GeneAmp PCR 2400 (Perkin-Elmer - Applied Biosystems) para TGradient 96 (Biometra, Alemania) en condiciones térmicas específicas para cada par de cebadores. Los productos de la PCR se separarán mediante electroforesis en geles de agarosa al 2 % y tampón de ejecución Tris-borato-EDTA (pH 8,0). La escalera de masa molecular (escalera de ADN de 100 pb, Gibco, Grand Island, NY, EE. UU.) se incluirá para ejecutar en el gel de agarosa. El ADN se tiñerá con 0,1 µl de Sybr Safe/mL (Invitrogen, CA, EE. UU.) y se visualizará bajo iluminación UV (Pharmacia LKB-MacroVue, San Gabriel, CA, EE. UU.). Se tomarán fotografías de las imágenes (Image Mater - LISCAP, VDS, Pharmacia Biotech Piscataway, NJ, EE. UU.) y se analizarán.