肺気腫および間質性線維症の患者で行われた組織生検におけるex vivoでのヒト肺幹細胞ニッチの状態の定義

科学的背景

変性肺障害は、正常な肺構造の破壊に至る炎症事象の結果です。 2 つの主なパターンが存在します。

1. 慢性閉塞性肺疾患 (COPD) は、罹患率と死亡率の主な原因です。 2020 年までは、心血管疾患、がんに続く死亡原因の第 3 位になると予想されています。 肺気腫は、肺胞組織が消失する COPD の破壊的な形態です。 この解剖学的パターンは常に均一であるとは限らず、機能障害は組織破壊の程度とは関係ありません。 破壊された組織の治療的除去は、手術によって、またはさまざまな遮断技術 (肺容量減少) を使用することによって達成できます。
2. 肺線維症 (PF) は、気道上皮の異常な修復によって特徴付けられます。 感染症、自己免疫（結合組織障害）、サルコイドーシス、過敏性肺炎、塵肺症、組織球症X、リンパ管平滑筋腫症LAMなど、さまざまな疾患がPFを引き起こす可能性があります。 多くの場合、因果関係を特定することはできず、この疾患は特発性 IPF です。

ここ数年の間に、前駆細胞とさまざまな足場を使用した細胞ベースの治療法がさまざまな医療分野で利用できるようになりました。 肺再生医療は、これらの末期疾患における移植に代わるものと思われます。

ただし、肺の非常に複雑な細胞組成は、40 を超える異なる細胞型を含むため、この目的は困難です。 伝導部分と呼吸部分で構成される気道の上皮内層は、その近位 - 遠位軸に沿って変化します。 人間の肺の気管から細気管支への伝導性気道は、基底細胞、分泌細胞、繊毛細胞、およびいくつかの神経内分泌細胞を同じ割合で含む偽重層上皮で構成されています。 末端細気管支および呼吸細気管支として知られる最小の細気管支は、基底細胞の少ない分泌細胞および繊毛細胞を含む単純な円柱状または立方状の上皮で覆われています。 これらの伝導性気道の上皮は、外界に対して緊密な障壁を形成し、粘液繊毛クリアランスのプロセスに特化しています。 肺胞は、以下ではそれぞれAT1およびAT2と呼ばれる1型および2型の肺胞上皮細胞によって裏打ちされています。 これらの細胞はバリア機能にも特化しており、非常に薄い AEC1 は基底膜を周囲の肺毛細血管ネットワークと共有して、大気と循環の間のガスの拡散を促進します。

上皮細胞タイプのこの一般的な分布は、ヒトとげっ歯類などのモデル生物の間で保存されています。 ただし、顕著な違いがあります。 たとえば、偽重層上皮から円柱上皮への移行は、げっ歯類ではより近位で発生するため、気管と主気管支だけが偽重層上皮で覆われています。 マウスのほぼすべての葉内気道は、基底細胞がほとんどない単純な円柱状または立方状の上皮で覆われています。 マウスでは、伝導性気道から肺胞への急激な移行は、気管支肺胞管接合部として知られています。 ヒトでは、終末細気管支が呼吸細気管支を生じ、そこから多くの肺胞管が最終的に肺胞で終わる。 肺における上皮コンパートメントの重要な役割を考慮すると、再生および修復機能に関与する上皮幹細胞および前駆細胞を特定するために多くの努力が払われてきました。

上皮前駆細胞は、豊富に神経支配されている血管細胞および間葉細胞に代表される独特の微小環境またはニッチに存在します。 このアーキテクチャは、HSM ニッチによく似ています。

マウスでは、肺上皮幹細胞の自己再生と分化を調節するシグナルの特定に向けて、かなりの進歩が見られました。 これらには、Notch、Hippo/Yap、ROS/Nrf2、EGF、FGF、c-myb、および IL-4、-13、-6 などのサイトカインが含まれます。 隣接する上皮細胞、間質細胞 (間葉系細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、内皮を含む)、および免疫細胞はすべて、これらの因子の潜在的な原因となります。 明確な幹細胞のニッチは、成体マウスの気管と定常状態の肺で定義されており、さまざまな病的状態で幹細胞のニッチが影響を受け、変化するという証拠が増えています。

成人のヒト肺における幹細胞と幹細胞のニッチ、および健康と疾患における肺組織の恒常性の維持を調節するシグナルについては、ほとんどわかっていません。

最近、ワイツマン研究所の Reisner グループは、マウスまたはヒトの肺前駆細胞の移植を成功させるには、肺幹細胞ニッチを空けることが前提条件であることを実証しました (Nature Medicine 2015)。 その目的のために、彼らは内因性前駆細胞の即時刺激を誘発するナフタレンによる最初の肺損傷を使用しました。 したがって、48 時間以内に分裂前駆細胞は 6 Gy の全身照射によって効果的に切除され、ドナー肺前駆細胞の効果的な生着が可能になりました (図 1)。

図 1: マウス胚性肺細胞による損傷した肺の生着と機能修復。 NA による肺損傷と 6Gy TBI によるコンディショニングの後、C57BL/6 成体マウスに GFP+ ドナーからの同系 E16 期胚性肺細胞を移植しました。 (a、b) 移植後 6 週間の移植マウスの肺の代表的な 2 光子顕微鏡拡張焦点画像。(a: z スタック 88μm) なし、および (b) ありのキメラ肺の上から下までのスキャン深度全体を示す) 量子ドット (赤) による血管の共染色 (バー = 90μm)。 (c) 2 光子拡張焦点画像。移植後 16 週間のキメラ肺 (z スタック 96μm) の上から下までのスキャン深度全体を示します。 (d) 背景を示す移植されていない C57BL マウスの肺の 2 光子顕微鏡 (バー = 90 μm)。 (e、f、g) 抗 GFP (緑) および抗 AQP-5 (赤) で染色されたキメラ肺の代表的な画像。ドナー由来の I 型肺胞細胞がガス交換表面に取り込まれていることを示しています。 (h、i、j) 抗 GFP (緑)、抗 Sp-C 抗体 (青) で染色されたキメラ肺は、II 型肺胞細胞を産生するドナー由来の界面活性剤を示しています (バー = 20μm)。 上記の個々の画像はすべて、3回の独立した実験からプールされたn = 10匹のマウスの代表です。 (m,n) 移植後 6 週間の肺機能測定値。 (k,l) CFTR (赤) および (GFP) のキメラ肺の染色。CFTR 陽性ドナー細胞を示しています。 (m) 肺のベースラインコンプライアンス。 コントロール無傷マウスと肺損傷マウスの比較 (スチューデントの t 検定、P < 0.001)、肺損傷マウスと損傷後に移植されたマウスの比較 (スチューデントの t 検定、P = 0.008)。 (n) 組織減衰。 コントロール マウスと肺損傷マウスの比較 (スチューデントの t 検定、P = 0.015)、肺損傷マウスと損傷後に移植されたマウスの比較 (スチューデントの t 検定、P = 0.021)。 値は、2 つの独立した実験からプールされた各グループの 10 ～ 15 (n = 15 コントロール、n = 10 損傷、n = 10 治療) マウスの平均値 ± SEM ですが、この条件付けは、ドナー肺前駆細胞の効果的な移植を可能にするために必要でした。通常のマウスでは、さまざまな肺疾患の患者では、肺ニッチがすでに部分的に枯渇している可能性があるため、移植に必要な条件がそれほど厳しくない可能性があると考えています。

目的:さまざまな臨床状況(気腫性および線維性肺組織と比較して非疾患)におけるニッチの幹細胞コンパートメントを特徴付け、in vitroでの増殖および発生特性を評価すること。

薬物スクリーニングと患者個別化医療の開発に肺オルガノイド培養システムをさらに実装する。

方法 肺組織の生検は、外科的処置によって得られます: 開放肺生検。 この手順は、線維性疾患の組織学的診断のために日常的に実行されます。 肺気腫および末期の線維性疾患の患者は、肺がんを発症するリスクが高くなります。 外科的に治療された肺がん患者の大部分は、組織学的背景として肺気腫と線維性疾患を持っています。 肺葉切除術および肺切除術は、肺がんの外科的管理における最先端の処置として頻繁に行われます。 切除された肺組織の一部には、気腫性および線維性変化が含まれているか、肉眼的および顕微鏡的に正常に見えます。 これらの「非癌性」領域は、線維性および気腫性領域からのサンプルと一緒に評価するために、シバ組織バンクでサンプリングおよび保存されます。 生検は、ワイツマン研究所の免疫学研究室で、免疫組織学、FACS、および 3D オルガノイド (線維芽細胞の除去後) によって分析されます。

すべてのサンプルは、このプロトコルの指定されたインフォームド コンセント フォームと組織バンク フォームの両方で、患者のインフォームド コンセント署名に従って収集されます。 週に 3 ～ 4 人の患者がいる場合もあります。 収集されたサンプルは、胸部外科部門または病理部門のいずれかの経験豊富な担当者によって切除されます (組織バンクでの職務記述書の一部として)。 新鮮なサンプルは、FACS および IHC のためにワイツマン研究所に輸送されます。

ヒトの肺組織に関する知識は非常に限られているため、健康な肺と病気の肺の肺組織をテストすることが必須になります。 最初は、2 年間で 10 ～ 15 の正常な肺組織と 15 ～ 20 の病気のサンプルをテストすることをお勧めします。 前に述べたように、正常な肺組織は、肺葉切除術/肺切除術を受けた患者から「非癌」領域として取得されます。