Definitie van de status van de menselijke longstamcelniches ex vivo in weefselbiopten uitgevoerd bij patiënten met emfyseem en interstitiële fibrose

Wetenschappelijke achtergrond

Degeneratieve longaandoeningen zijn het resultaat van ontstekingsgebeurtenissen die eindigen in vernietiging van de normale longarchitectuur. Er zijn twee hoofdpatronen:

1. Chronische obstructieve longziekte (COPD) is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit. Tot 2020 wordt het naar verwachting de derde doodsoorzaak na hart- en vaatziekten en kanker. Emfyseem is de destructieve vorm van COPD als het alveolaire weefsel verdwijnt. Dit anatomische patroon is niet altijd homogeen en functiebeperking staat niet in verband met de mate van weefselvernietiging. Therapeutische eliminatie van het vernietigde weefsel kan worden bereikt door middel van een operatie of door gebruik te maken van verschillende blokkeringstechnieken (Lung Volume Reduction).
2. Pulmonale fibrose (PF) wordt gekenmerkt door abnormaal herstel van het respiratoire epitheel. Verschillende ziekten kunnen PF tot gevolg hebben, zoals infecties, auto-immuunziekten (bindweefselaandoeningen), sarcoïdose, overgevoeligheidspneumonitis, pneumoconiose, histiocytose X, lymfangioleiomyomatose LAM enz. In veel situaties kan geen oorzaak-gevolgrelatie worden vastgesteld en is de ziekte idiopathische IPF.

Gedurende de laatste jaren kwamen op cellen gebaseerde therapieën die gebruik maken van progenitorcellen en verschillende scaffolds beschikbaar op verschillende medische gebieden. Longregeneratieve geneeskunde lijkt een alternatief te zijn voor transplantatie bij deze eindstadiumziekten.

De zeer complexe cellulaire samenstelling van de long, bestaande uit meer dan 40 verschillende celtypen, maakt dit doel echter een uitdaging. De epitheliale bekleding van de luchtwegen, bestaande uit geleidende en ademhalingsdelen, varieert langs de proximo-distale as. De geleidende luchtwegen van de luchtpijp naar de bronchiolen van de menselijke longen bestaan ​​uit pseudostratified epitheel, bestaande uit gelijke delen basale cellen, secretoire cellen en trilharencellen, evenals enkele neuro-endocriene cellen. De kleinste bronchiolen, bekend als terminale en respiratoire bronchiolen, zijn bekleed met een eenvoudig zuilvormig of kubusvormig epitheel dat secretoire en trilhaarcellen bevat met minder basale cellen. Het epitheel van deze geleidende luchtwegen vormt een strakke barrière tegen de buitenwereld en is gespecialiseerd in het proces van mucociliaire klaring. De longblaasjes zijn bekleed met type 1 en 2 alveolaire epitheelcellen, hierna respectievelijk AT1 en AT2 genoemd. Deze cellen zijn ook gespecialiseerd in hun barrièrefunctie en de extreem dunne AEC1's delen een basaalmembraan met het omringende netwerk van longcapillairen om de diffusie van gassen tussen de atmosfeer en de circulatie te vergemakkelijken.

Deze algemene verdeling van epitheelceltypen is behouden tussen mensen en modelorganismen zoals knaagdieren. Er zijn echter opmerkelijke verschillen. De overgang van een pseudostratified naar cilindrisch epitheel vindt bijvoorbeeld meer proximaal plaats bij knaagdieren, dus alleen de luchtpijp en de hoofdbronchiën zijn bekleed met een pseudostratified epitheel. Bijna alle intralobaire luchtwegen bij muizen zijn bekleed met een eenvoudig zuilvormig of kubusvormig epitheel met weinig basale cellen. Bij muizen staat de abrupte overgang van een geleidende luchtweg naar de longblaasjes bekend als een broncho-alveolaire kanaalovergang. Bij mensen geven terminale bronchiolen aanleiding tot respiratoire bronchiolen van waaruit veel alveolaire kanalen uiteindelijk eindigen in longblaasjes. Gezien de essentiële rol van het epitheliale compartiment in de long is er veel moeite gedaan om epitheliale stamcellen en progenitorcellen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor regeneratieve en herstellende functies.

Epitheliale voorlopers bevinden zich in een unieke micro-omgeving of niches, vertegenwoordigd door vasculaire en mesenchymale cellen, die rijkelijk worden geïnnerveerd. Deze architectuur lijkt sterk op HSM-niches.

Bij muizen is aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het identificeren van de signalen die de zelfvernieuwing en differentiatie van longepitheelstamcellen reguleren. Deze omvatten Notch, Hippo/Yap, ROS/Nrf2, EGF, FGF, c-myb en cytokinen waaronder IL-4, -13 en -6. Naburige epitheelcellen, stromale cellen (waaronder mesenchymcellen, fibroblasten, gladde spiercellen en endotheel) en immuuncellen zijn allemaal potentiële bronnen voor deze factoren. Verschillende stamcelniches zijn gedefinieerd in de luchtpijp en long van volwassen muizen in de stabiele toestand en er is toenemend bewijs dat in verschillende pathologische omstandigheden stamcelniches worden aangetast en veranderd.

Er is zeer weinig bekend over stamcellen en stamcelniches in de longen van volwassen mensen en de signalen die de instandhouding van de longweefselhomeostase bij gezondheid en ziekte reguleren.

Onlangs heeft de Reisner-groep van het Weizmann Institute aangetoond dat het vrijmaken van de niches van de longstamcellen een voorwaarde is voor een succesvolle transplantatie van muizen- of menselijke longvoorlopercellen (Nature Medicine 2015). Daartoe gebruikten ze een initiële longbeschadiging met naftaleen, wat een onmiddellijke stimulatie van endogene voorlopercellen op gang bracht. Aldus konden binnen 48 uur de delende voorlopercellen effectief worden geablateerd door 6 Gy bestraling van het gehele lichaam, waardoor effectieve implantatie van donorlongvoorlopercellen mogelijk werd (fig. 1).

Fig. 1: Implantatie en functioneel herstel van beschadigde longen door embryonale longcellen van muizen. Na longbeschadiging met NA en conditionering met 6Gy TBI, werden volwassen C57BL/6-muizen getransplanteerd met syngene embryonale longcellen in het E16-stadium van GFP+-donoren. ( a, b ) Representatieve twee-fotonenmicroscopie verlengde focusbeelden van de longen van getransplanteerde muizen 6 weken na transplantatie, waarbij de volledige scandiepte van boven naar beneden van de chimere long wordt getoond, zonder ( a: z-stack 88 μm), en met ( b ) co-kleuring van bloedvaten met Quantum dots (rood) (bar=90μm). ( c ) Twee-foton uitgebreid focusbeeld, dat de volledige scandiepte van boven naar beneden van chimere long (z-stack 96 μm) 16 weken na transplantatie laat zien. ( d ) Twee-fotonenmicroscopie van niet-getransplanteerde C57BL-muizenlong met achtergrond (balk = 90 μm). ( e, f, g ) Representatieve afbeeldingen van chimere longen gekleurd met anti-GFP (groen) en anti-AQP-5 (rood), wat wijst op opname van van donor afkomstige type I alveocyten in het gasuitwisselingsoppervlak. ( h, i, j ) Chimere long gekleurd met anti-GFP (groen), anti-Sp-C-antilichamen (blauw), die van een donor afgeleide oppervlakteactieve stof aantoont die type II alveocyten produceert (staven = 20 μm). Alle afzonderlijke afbeeldingen die hierboven worden getoond, zijn representatief voor n = 10 muizen die zijn samengevoegd uit 3 onafhankelijke experimenten. (m,n) Longfunctiemetingen 6 weken na transplantatie. ( k, l ) Kleuring van chimere long voor CFTR (rood) en (GFP), wat CFTR-positieve donorcellen aantoont. (m) Naleving van de basislijn van de longen. Vergelijking van intacte controlemuizen versus muizen met longbeschadiging (Student's t-test, P<0,001), en van muizen met longbeschadiging versus muizen getransplanteerd na verwonding (Student's t-test, P=0,008). (n) Weefseldemping. Vergelijking van controlemuizen versus muizen met longbeschadiging (Student's t-test, P=0,015), en van muizen met longbeschadiging versus muizen getransplanteerd na verwonding (Student's t-test, P=0,021). Waarden zijn gemiddelden ± SEM van 10-15 (n=15 controle, n=10 gewonde en n=10 behandelde) muizen in elke groep samengevoegd uit twee onafhankelijke experimenten. normale muizen, stellen we ons voor dat bij patiënten met verschillende longziekten de longniches al gedeeltelijk uitgeput kunnen zijn en dat transplantatie daarom mogelijk minder ernstige conditionering vereist.

Doelstelling Stamcelcompartimenten karakteriseren in hun niches in verschillende klinische situaties (niet-ziek vergeleken met emfysemateus en fibrotisch longweefsel) en hun proliferatieve en ontwikkelingseigenschappen in vitro beoordelen.

Verdere implementatie van het long-organoïde-kweeksysteem bij de screening van geneesmiddelen en de ontwikkeling van gepersonaliseerde geneeskunde voor de patiënt.

Methoden Biopsies van longweefsel worden verkregen door middel van chirurgische ingrepen: open longbiopten. Deze procedure wordt routinematig uitgevoerd voor histologische diagnose van fibrotische ziekten. Patiënten met emfyseem en eindstadium fibrotische ziekte lopen een groter risico om longkanker te ontwikkelen. Een groot deel van de chirurgisch behandelde longkankerpatiënten heeft emfyseem en fibrotische ziekte als histologische achtergrond. Lobectomie en pneumonectomie worden vaak uitgevoerd als geavanceerde procedures bij de chirurgische behandeling van longkanker. Een deel van het gereseceerde longweefsel bevat emfyseem- en fibrotische veranderingen of ziet er macroscopisch en microscopisch normaal uit. Deze "niet-kankerachtige" gebieden zullen worden bemonsterd en bewaard in de Sheba Tissue Bank voor evaluatie, samen met monsters van fibrotische en emfyseemgebieden. De biopsieën zullen worden geanalyseerd door middel van immunohistologie, FACS en 3D-organoïden (na verwijdering van fibroblasten) in het immunologisch laboratorium van het Weizmann Institute.

Alle monsters worden verzameld na handtekeningen van patiënten met geïnformeerde toestemming, zowel op het aangewezen toestemmingsformulier voor dit protocol als op het weefselbankformulier. We kunnen wel 3-4 patiënten per week hebben. Verzamelde monsters zullen worden verwijderd door ervaren personeel van de afdeling Thoraxchirurgie of de afdeling Pathologie (als onderdeel van hun taakomschrijving in de Weefselbank). Verse monsters worden vervoerd naar het Weizmann-instituut voor FACS en IHC.

Aangezien er zeer beperkte kennis bestaat over menselijk longweefsel, zal het verplicht zijn om longweefsel van gezonde en zieke longen te testen. In eerste instantie stellen we voor om 10-15 normale longweefsels en 15-20 zieke monsters te testen gedurende een periode van 2 jaar. Zoals eerder vermeld, zullen de normale longweefsels worden verkregen als "niet-kankerachtige" gebieden van patiënten die lobectomieën/pneumonectomieën ondergaan.