Az emberi tüdő őssejt-réseinek ex vivo státuszának meghatározása emfizémás és intersticiális fibrózisos betegeknél végzett szövetbiopsziákban

Tudományos háttér

A degeneratív tüdőbetegségek olyan gyulladásos események következményei, amelyek a normál tüdőszerkezet tönkretételével végződnek. Két fő minta létezik:

1. A krónikus obstruktív tüdőbetegség (COPD) a morbiditás és halálozás egyik fő oka. 2020-ig várhatóan ez lesz a harmadik halálozási ok a szív- és érrendszeri betegségek és a rák után. Az emfizéma a COPD destruktív formája, amikor az alveolált szövet eltűnik. Ez az anatómiai mintázat nem mindig homogén, és a funkcionális károsodás nem függ össze a szövetpusztulás mértékével. Az elpusztult szövet terápiás eltávolítása műtéttel vagy különböző blokkoló technikák (tüdőtérfogat-csökkentés) alkalmazásával érhető el.
2. A tüdőfibrózist (PF) a légúti epitélium rendellenes helyreállítása jellemzi. Különféle betegségek okozhatnak PF-t, például fertőzések, autoimmun (kötőszöveti betegségek), sarcoidosis, túlérzékenységi pneumonitis, pneumoconiosis, histiocytosis X, lymphangioleiomyomatosis LAM stb. Sok esetben nem lehet azonosítani az ok-okozati összefüggést, és a betegség idiopátiás IPF.

Az elmúlt években a progenitor sejteket és különféle állványzatokat alkalmazó sejtalapú terápiák váltak elérhetővé az orvostudomány különböző területein. A tüdőregeneratív gyógyászat a transzplantáció alternatívájának tűnik ezekben a végstádiumú betegségekben.

Azonban a tüdő nagyon összetett sejtösszetétele, amely több mint 40 különböző sejttípust tartalmaz, kihívást jelent ennek a célkitűzésnek az elérése érdekében. A légutak hámrétege, amely vezető és légző részekből áll, a proximo-distalis tengely mentén változik. Az emberi tüdő légcsövétől a hörgőig vezető légutak pszeudosztratizált hámból állnak, amely egyenlő arányban tartalmaz bazális sejteket, szekréciós sejteket és csillós sejteket, valamint néhány neuroendokrin sejtet. A legkisebb hörgőket, amelyeket terminális és légúti hörgőknek neveznek, egyszerű oszlopos vagy kocka alakú hám borítja, amely szekréciós és csillós sejteket tartalmaz, kevesebb bazális sejttel. Ezen vezető légutak hámrétegei szoros gátat képeznek a külvilággal szemben, és a mukociliáris kiürülési folyamatra specializálódtak. Az alveolusokat 1-es és 2-es típusú alveoláris hámsejtek bélelik, amelyeket a továbbiakban AT1-nek, illetve AT2-nek nevezünk. Ezek a sejtek a barrier funkcióra is specializálódtak, és a rendkívül vékony AEC1-ek alapmembránon osztoznak a környező tüdőkapillárisok hálózatával, hogy megkönnyítsék a gázok diffúzióját a légkör és a keringés között.

Az epiteliális sejttípusok általános megoszlása ​​az emberek és a modellszervezetek, például a rágcsálók között konzervált. Vannak azonban jelentős különbségek. Például a rágcsálókban a pszeudosztratifikált hámról az oszlopos hámra való átmenet inkább proximálisan megy végbe, így csak a légcső és a törzshörgők bélelik pszeudosztratifikált epitéliummal. Az egerekben szinte minden intralobar légút egy egyszerű oszlopos vagy kocka alakú epitéliummal van bélelve, kevés bazális sejttel. Egereknél a vezető légutakból az alveolusokba történő hirtelen átmenetet hörgő-alveoláris csatorna csomópontnak nevezik. Emberben a terminális hörgők légúti hörgőket eredményeznek, amelyekből sok alveoláris csatorna végül az alveolusokban végződik. Figyelembe véve a hámrekesznek a tüdőben betöltött alapvető szerepét, sok erőfeszítést tettek a regeneratív és reparatív funkciókért felelős epiteliális ős- és progenitor sejtek azonosítására.

Az epiteliális progenitorok egyedi mikrokörnyezetben vagy fülkékben találhatók, amelyeket vaszkuláris és mesenchymális sejtek képviselnek, amelyek gazdagon beidegződnek. Ez az architektúra nagyon hasonlít a HSM résekre.

Jelentős előrelépés történt egerekben a tüdő epiteliális őssejt-megújulását és differenciálódását szabályozó jelek azonosításában. Ezek közé tartozik a Notch, Hippo/Yap, ROS/Nrf2, EGF, FGF, c-myb és citokinek, beleértve az IL-4-et, -13-at és -6-ot. A szomszédos hámsejtek, a stromasejtek (beleértve a mesenchymalis sejteket, a fibroblasztokat, a simaizomsejteket és az endotéliumot) és az immunsejtek mind potenciális forrásai ezeknek a tényezőknek. Különleges őssejt-réseket határoztak meg a felnőtt egér légcsövében és tüdejében egyensúlyi állapotban, és egyre több bizonyíték áll rendelkezésre arra vonatkozóan, hogy különböző patológiás körülmények között az őssejt-réseket érintik és megváltoztatják.

Nagyon keveset tudunk az őssejtekről és az őssejt-résekről az emberi felnőtt tüdőben, valamint azokról a jelekről, amelyek szabályozzák a tüdőszövet homeosztázisának fenntartását egészségben és betegségekben.

Nemrég a Weizmann Intézet Reisner-csoportja bebizonyította, hogy a tüdő őssejt-réseinek felszabadítása előfeltétele az egér vagy emberi tüdő progenitorok sikeres átültetésének (Nature Medicine 2015). Ebből a célból egy kezdeti tüdősérülést alkalmaztak naftalinnal, amely azonnali stimulációt váltott ki az endogén progenitorokban. Így 48 órán belül az osztódó progenitorok hatékonyan eltávolíthatók 6 Gy teljes test besugárzással, lehetővé téve a donor tüdő progenitorok hatékony beültetését (1. ábra).

1. ábra: Sérült tüdő beültetése és funkcionális helyreállítása egér embrionális tüdősejtekkel. NA-val okozott tüdősérülést és 6Gy TBI-val történő kondicionálást követően C57BL/6 felnőtt egereket ültettünk át GFP+ donoroktól származó szingén E16 stádiumú embrionális tüdősejtekkel. (a, b) Reprezentatív kétfotonos mikroszkópos kiterjesztett fókuszú képek az átültetett egerek tüdejéről 6 héttel a transzplantáció után, a teljes szkennelési mélységet a kiméra tüdő tetejétől lefelé, anélkül (a: z-stack 88μm) és (b) nélkül. ) az erek együttfestése kvantumpontokkal (piros) (bar=90μm). (c) Kétfoton kiterjesztett fókuszú kép, amely a teljes szkennelési mélységet mutatja a kiméra tüdő tetejétől lefelé (z-stack 96 μm) 16 héttel a transzplantáció után. (d) A nem transzplantált C57BL egértüdő kétfotonos mikroszkópja, amely a hátteret mutatja (sáv = 90 μm). (e, f, g) Az anti-GFP-vel (zöld) és anti-AQP-5-tel (piros) festett kiméra tüdő reprezentatív képei, jelezve a donor eredetű I-es típusú alveociták beépülését a gázcsere felületbe. (h,i,j) Anti-GFP-vel (zöld), anti-Sp-C antitestekkel (kék) festett kiméra tüdő, amely donor eredetű felületaktív anyagot termel, amely II-es típusú alveocitákat termel (oszlopok=20 μm). A fent bemutatott összes kép n=10 egeret reprezentál, amelyeket 3 független kísérletből vettek össze. (m,n) Tüdőfunkció mérések 6 héttel a transzplantáció után. (k,l) Kiméra tüdő festése CFTR-re (piros) és (GFP), CFTR-pozitív donorsejtek kimutatására. m) A tüdő alapvonal-megfelelősége. Kontroll intakt egerek és tüdősérüléses egerek (Student t-teszt, P<0,001), valamint tüdősérült egerek és sérülés után átültetett egerek összehasonlítása (Student t-teszt, P=0,008). n) Szövet csillapítás. Kontroll egerek és tüdősérült egerek összehasonlítása (Student t-teszt, P=0,015), valamint tüdősérült egerek és sérülés után átültetett egerek összehasonlítása (Student t-tesztje, P=0,021). Az értékek 10-15 (n=15 kontroll, n=10 sérült és n=10 kezelt) egér átlag ± SEM értékei minden csoportban, két független kísérletből összevonva, bár ez a kondicionálás szükséges volt a donor tüdő progenitorok hatékony beültetése érdekében. normál egerek esetében azt képzeljük, hogy a különböző tüdőbetegségekben szenvedő betegeknél a tüdőrések már részben kimerültek, ezért a transzplantáció kevésbé súlyos kondicionálást igényelhet.

Célkitűzés Különböző klinikai szituációkban jellemezni az őssejt-kompartmenteket a fülkéikben (nem beteg az emphysemás és fibrotikus tüdőszövethez képest), valamint in vitro felmérni proliferációs és fejlődési tulajdonságaikat.

Tüdőorganoid tenyésztési rendszer további megvalósítása a gyógyszerszűrésben és a beteg-személyre szabott gyógyászat fejlesztésében.

Módszerek A tüdőszövet biopsziáját sebészeti eljárásokkal veszik: nyílt tüdőbiopsziával. Ezt az eljárást rutinszerűen végzik a fibrotikus betegségek szövettani diagnosztizálására. Az emfizémában és végstádiumú fibrotikus betegségben szenvedő betegeknél nagyobb a tüdőrák kialakulásának kockázata. A sebészileg kezelt tüdőrákos betegek nagy részének szövettani háttere emfizéma és fibrotikus betegség áll. A lobektómiát és a pneumonectomiát gyakran a legkorszerűbb eljárásokként végzik a tüdőrák sebészeti kezelésében. A kimetszett tüdőszövet egy része emfizémás és fibrotikus elváltozásokat tartalmaz, vagy makroszkóposan és mikroszkopikusan normálisnak tűnik. Ezekről a „nem rákos” területekről mintát vesznek, és a Sheba Tissue Bankban tárolják értékelés céljából a fibrotikus és tüdőtágulásos területekről származó mintákkal együtt. A biopsziákat immunhisztológia, FACS és 3D organoidok segítségével elemzik (a fibroblasztok eltávolítása után) a Weizmann Intézet immunológiai laboratóriumában.

Minden mintát a betegek tájékoztatáson alapuló beleegyező aláírását követően gyűjtenek, mind az ehhez a protokollhoz kijelölt, mind a szövetbanki űrlapon. Akár heti 3-4 betegünk is lehet. Az összegyűjtött mintákat a Mellkassebészeti Osztály vagy a Patológiai Osztály tapasztalt munkatársai eltávolítják (a Szövetbankban található munkaköri leírásuk részeként). A friss mintákat a Weizmann intézetbe szállítják a FACS és az IHC számára.

Mivel az emberi tüdőszövetekről nagyon korlátozott ismeretek állnak rendelkezésre, kötelező lesz az egészséges és beteg tüdőből származó tüdőszövetek vizsgálata. Kezdetben 10-15 normál tüdőszövet és 15-20 beteg minta vizsgálatát javasoljuk 2 év alatt. Amint azt korábban említettük, a normál tüdőszöveteket "nem rákos" területként nyerik ki a lobectomián/pneumonektómián átesett betegektől.