Definisjon av statusen til menneskelige lungestamcellenisjer ex vivo i vevsbiopsier utført hos pasienter med emfysem og interstitiell fibrose

Vitenskapelig bakgrunn

Degenerative lungelidelser er et resultat av inflammatoriske hendelser som ender i ødeleggelse av den normale lungearkitekturen. Det finnes to hovedmønstre:

1. Kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS) er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet. Frem til 2020 forventes det å bli den tredje årsaken til dødelighet etter hjerte- og karsykdommer og kreft. Emfysem er den destruktive formen for KOLS når det alveolerte vevet forsvinner. Dette anatomiske mønsteret er ikke alltid homogent og funksjonsnedsettelse er ikke knyttet til omfanget av vevsdestruksjonen. Terapeutisk eliminering av det ødelagte vevet kan oppnås ved kirurgi eller ved bruk av ulike blokkeringsteknikker (lungevolumreduksjon).
2. Lungefibrose (PF) er preget av unormal reparasjon av respiratorisk epitel. Ulike sykdommer kan resultere i PF som infeksjoner, autoimmune (bindevevsforstyrrelser), sarkoidose, hypersensitivitetspneumonitt, pneumokoniose, histiocytose X, lymphangioleiomyomatosis LAM etc. I mange situasjoner kan en årsak og virkning ikke identifiseres, og sykdommen er idiopatisk IPF.

I løpet av de siste årene ble cellebaserte terapier ved bruk av stamceller og ulike stillaser tilgjengelig innen ulike medisinske felt. Lungeregenerativ medisin ser ut til å være et alternativ til transplantasjon ved disse sluttstadiumsykdommene.

Imidlertid gjør svært kompleks cellulær sammensetning av lungen, som omfatter mer enn 40 forskjellige celletyper, dette målet utfordrende. Epitelslimhinnen i luftveiene, sammensatt av ledende og respiratoriske deler, varierer langs dens proksimo-distale akse. De ledende luftveiene fra luftrøret til bronkiolene i menneskelige lunger består av pseudostratifisert epitel, som omfatter like proporsjoner av basalceller, sekretoriske celler og cilierte celler, samt noen nevroendokrine celler. De minste bronkiolene, kjent som terminale og respiratoriske bronkioler, er foret med et enkelt søyleformet eller kubisk epitel som inneholder sekretoriske og cilierte celler med færre basalceller. Epitelet til disse ledende luftveiene danner en tett barriere mot omverdenen og er spesialisert for prosessen med mucociliær clearance. Alveolene er foret med type 1 og 2 alveolære epitelceller, kalt henholdsvis AT1 og AT2, heretter. Disse cellene er også spesialisert for barrierefunksjon, og de ekstremt tynne AEC1-ene deler en basalmembran med det omkringliggende nettverket av lungekapillærer for å lette diffusjonen av gasser mellom atmosfæren og sirkulasjonen.

Denne generelle fordelingen av epitelcelletyper er bevart mellom mennesker og modellorganismer som gnagere. Det er imidlertid merkbare forskjeller. For eksempel skjer overgangen fra et pseudostratifisert til søyleepitel mer proksimalt hos gnagere, så bare luftrøret og hovedstammens bronkier er foret med et pseudostratifisert epitel. Nesten alle intralobare luftveier hos mus er foret med et enkelt søyleformet eller kubisk epitel med få basalceller. Hos mus er den brå overgangen fra en ledende luftvei til alveolene kjent som en bronko-alveolær kanalforbindelse. Hos mennesker gir terminale bronkioler opphav til respiratoriske bronkioler hvorfra mange alveolære kanaler ender til slutt i alveolene. Tatt i betraktning den essensielle rollen til epitelrommet i lungen har det blitt gjort mye arbeid for å identifisere epitelstam- og stamceller som er ansvarlige for regenerative og reparative funksjoner.

Epiteliale stamceller bor i unike mikromiljøer eller nisjer, representert av vaskulære og mesenkymale celler, som er rikt innervert. Denne arkitekturen minner mye om HSM-nisjer.

Det er gjort betydelige fremskritt hos mus mot å identifisere signalene som regulerer selvfornyelse og differensiering av lungeepitelstamceller. Disse inkluderer Notch, Hippo/Yap, ROS/Nrf2, EGF, FGF, c-myb og cytokiner inkludert IL-4, -13 og -6. Naboepitelceller, stromaceller (inkludert mesenkymale celler, fibroblaster, glatte muskelceller og endotel) og immunceller representerer alle potensielle kilder for disse faktorene. Distinkte stamcellenisjer er definert i luftrør og lunger hos voksne mus i steady state, og det er økende bevis på at stamcellenisjer under forskjellige patologiske tilstander påvirkes og endres.

Svært lite er kjent om stamceller og stamcellenisjer i menneskelige voksne lunger og signalene som regulerer vedlikehold av lungevevets homeostase i helse og sykdom.

Nylig har Reisner-gruppen ved Weizmann-instituttet vist at det å forlate lungestamcellenisjene er en forutsetning for vellykket transplantasjon av muse- eller menneskelige lungeforfedre (Nature Medicine 2015). Til det formål brukte de en innledende lungeskade med naftalen som utløste en umiddelbar stimulering av endogene stamceller. Innen 48 timer kunne således de delende stamfadere effektivt ableres ved 6 Gy total kroppsbestråling som muliggjorde effektiv engraftment av donorlungeprogenitorer (fig. 1).

Fig. 1: Engraftment og funksjonell reparasjon av skadde lunger av embryonale lungeceller fra mus. Etter lungeskade med NA og kondisjonering med 6Gy TBI, ble C57BL/6 voksne mus transplantert med syngene E16-stadium embryonale lungeceller fra GFP+-givere. (a,b) Representative to-fotonmikroskopi utvidet fokusbilder av lungene til transplanterte mus 6 uker etter transplantasjon, som viser hele skannedybden fra topp til bunn av kimær lunge, uten (a: z-stack 88μm), og med (b) ) co-farging av blodårer med Quantum dots (røde) (bar=90μm). (c) To-foton utvidet fokusbilde, som viser hele skannedybden fra topp til bunn av kimær lunge (z-stack 96μm) 16 uker etter transplantasjon. (d) To-fotonmikroskopi av ikke-transplantert C57BL muselunge som viser bakgrunn (bar=90μm). (e,f,g) Representative bilder av kimære lunger farget med anti-GFP (grønn) og anti-AQP-5 (rød), som indikerer inkorporering av donor-avledede type I alveocytter i gassutvekslingsoverflaten. (h,i,j) Kimerisk lunge farget med anti-GFP (grønn), anti-Sp-C antistoffer (blå), viser donoravledet overflateaktivt middel som produserer type II alveocytter (barer=20μm). Alle de individuelle bildene vist ovenfor er representative for n=10 mus samlet fra 3 uavhengige eksperimenter. (m,n) Lungefunksjonsmålinger 6 uker etter transplantasjon. (k,l) Farging av kimær lunge for CFTR (rød) og (GFP), som viser CFTR-positive donorceller. (m) Overholdelse av lungebasislinje. Sammenligning av intakte kontrollmus vs mus med lungeskade (Students t-test, P<0,001), og av mus med lungeskade vs mus transplantert etter skade (Students t-test, P=0,008). (n) Vevsdemping. Sammenligning av kontrollmus vs mus med lungeskade (Students t-test, P=0,015), og av mus med lungeskade vs mus transplantert etter skade (Students t-test, P=0,021). Verdiene er gjennomsnitt ± SEM for 10-15 (n=15 kontroll, n=10 skadde og n=10 behandlede) mus i hver gruppe samlet fra to uavhengige eksperimenter. Selv om denne kondisjoneringen var nødvendig for å muliggjøre effektiv engraftment av donorlungeforfedre i normale mus, ser vi for oss at hos pasienter med forskjellige lungesykdommer kan lungenisjene allerede være delvis utarmet, og derfor kan transplantasjon kreve mindre alvorlig kondisjonering.

Mål Å karakterisere stamcellekompartmenter i deres nisjer i forskjellige kliniske situasjoner (ikke-syke sammenlignet med emfysematøst og fibrotisk lungevev) og å vurdere deres proliferative og utviklingsmessige egenskaper in vitro.

Å videre implementere lungeorganoidkultursystem i medikamentscreening og utvikling av pasienttilpasset medisin.

Metoder Biopsier av lungevev vil bli tatt ved kirurgiske prosedyrer: åpne lungebiopsier. Denne prosedyren utføres rutinemessig for histologisk diagnose av fibrotiske sykdommer. Pasienter med emfysem og fibrotisk sykdom i sluttstadiet har høyere risiko for å utvikle lungekreft. En stor andel av kirurgisk behandlede lungekreftpasienter har emfysem og fibrotisk sykdom som histologisk bakgrunn. Lobektomi og pneumonektomi utføres ofte som avanserte prosedyrer ved kirurgisk behandling av lungekreft. En del av det resekerte lungevevet inneholder emfysematøse og fibrotiske forandringer eller får det til å se makroskopisk og mikroskopisk normalt ut. Disse "ikke-kreftøse" områdene vil bli tatt prøver av og bevart ved Sheba Tissue Bank for evaluering sammen med prøver fra fibrotiske og emfysematøse områder. Biopsiene vil bli analysert med immunhistologi, FACS og 3D-organoider (etter fjerning av fibroblaster) ved immunologilaboratoriet ved Weizmann Institute.

Alle prøver vil bli samlet etter informerte samtykkesignaturer fra pasienter både på det utpekte informerte samtykkeskjemaet for denne protokollen og vevsbankskjemaet. Vi kan ha så mange som 3-4 pasienter/uke. Innsamlede prøver vil bli reseksjonert av erfarent personell enten fra thoraxkirurgisk avdeling eller patologisk avdeling (som en del av deres stillingsbeskrivelse i vevsbanken). Ferske prøver vil bli fraktet til Weizmann-instituttet for FACS og IHC.

Siden det er svært begrenset kunnskap om menneskelig lungevev, vil det være obligatorisk å teste lungevev fra friske og syke lunger. I utgangspunktet foreslår vi å teste 10-15 normalt lungevev og 15-20 syke prøver i løpet av en periode på 2 år. Som nevnt før vil det normale lungevevet fås som "ikke-kreft" områder fra pasienter som gjennomgår lobektomi/pneumonektomi.