Определение статуса ниш стволовых клеток легких человека ex vivo в биопсиях тканей, выполненных у пациентов с эмфиземой и интерстициальным фиброзом

Научная основа

Дегенеративные заболевания легких являются результатом воспалительных явлений, которые заканчиваются разрушением нормальной легочной архитектуры. Существуют два основных шаблона:

1. Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) является основной причиной заболеваемости и смертности. Ожидается, что до 2020 года она станет третьей причиной смертности после сердечно-сосудистых заболеваний и рака. Эмфизема является деструктивной формой ХОБЛ, поскольку альвеолярная ткань исчезает. Эта анатомическая картина не всегда однородна, а функциональные нарушения не связаны со степенью разрушения тканей. Терапевтическое устранение разрушенной ткани может быть достигнуто хирургическим путем или с использованием различных методов блокирования (уменьшение объема легких).
2. Легочный фиброз (ПФ) характеризуется патологическим восстановлением респираторного эпителия. К ПФ могут привести различные заболевания, такие как инфекции, аутоиммунные заболевания (заболевания соединительной ткани), саркоидоз, гиперчувствительный пневмонит, пневмокониоз, гистиоцитоз X, лимфангиолейомиоматоз LAM и т. д. Во многих ситуациях причинно-следственная связь не может быть установлена, и заболевание является идиопатическим ИЛФ.

В последние годы клеточная терапия с использованием клеток-предшественников и различных каркасов стала доступной в различных областях медицины. Регенеративная медицина легких, по-видимому, является альтернативой трансплантации при этих терминальных стадиях заболеваний.

Однако очень сложный клеточный состав легких, включающий более 40 различных типов клеток, делает эту задачу сложной. Эпителиальная выстилка дыхательных путей, состоящая из проводящей и дыхательной частей, варьирует по своей проксимально-дистальной оси. Проводящие дыхательные пути от трахеи к бронхиолам легких человека состоят из псевдомногослойного эпителия, включающего в равном количестве базальные клетки, секреторные клетки и реснитчатые клетки, а также некоторые нейроэндокринные клетки. Наименьшие бронхиолы, известные как терминальные и респираторные бронхиолы, выстланы простым столбчатым или кубическим эпителием, содержащим секреторные и реснитчатые клетки с меньшим количеством базальных клеток. Эпителий этих проводящих дыхательных путей образует плотный барьер для внешнего мира и специализирован для процесса мукоцилиарного клиренса. Альвеолы ​​выстланы альвеолярными эпителиальными клетками 1 и 2 типа, далее называемыми АТ1 и АТ2 соответственно. Эти клетки также специализируются на барьерной функции, и чрезвычайно тонкие AEC1 имеют общую базальную мембрану с окружающей сетью легочных капилляров, чтобы облегчить диффузию газов между атмосферой и кровообращением.

Это общее распределение типов эпителиальных клеток сохраняется между людьми и модельными организмами, такими как грызуны. Однако есть заметные различия. Например, переход от псевдомногослойного эпителия к цилиндрическому у грызунов происходит более проксимально, поэтому только трахея и главные бронхи выстланы псевдомногослойным эпителием. Почти все внутридолевые дыхательные пути у мышей выстланы простым столбчатым или кубическим эпителием с небольшим количеством базальных клеток. У мышей резкий переход от проводящих дыхательных путей к альвеолам известен как соединение бронхоальвеолярных протоков. У человека терминальные бронхиолы дают начало респираторным бронхиолам, от которых многие альвеолярные протоки в конечном итоге заканчиваются альвеолами. Учитывая существенную роль эпителиального компартмента в легком, было предпринято много усилий для идентификации эпителиальных стволовых клеток и клеток-предшественников, ответственных за регенеративные и репаративные функции.

Эпителиальные предшественники находятся в уникальном микроокружении или нишах, представленных сосудистыми и мезенхимальными клетками, которые богато иннервированы. Эта архитектура очень напоминает ниши HSM.

У мышей был достигнут значительный прогресс в идентификации сигналов, которые регулируют самообновление и дифференцировку легочных эпителиальных стволовых клеток. К ним относятся Notch, Hippo/Yap, ROS/Nrf2, EGF, FGF, c-myb и цитокины, включая IL-4, -13 и -6. Соседние эпителиальные клетки, стромальные клетки (включая мезенхимальные клетки, фибробласты, гладкомышечные клетки и эндотелий) и иммунные клетки представляют собой потенциальные источники этих факторов. Определенные ниши стволовых клеток были определены в трахее и легких взрослых мышей в стационарном состоянии, и появляется все больше доказательств того, что при различных патологических состояниях ниши стволовых клеток затрагиваются и изменяются.

Очень мало известно о стволовых клетках и нишах стволовых клеток в легких взрослого человека, а также о сигналах, которые регулируют поддержание гомеостаза легочной ткани в норме и при патологии.

Недавно группа Рейснера из Института Вейцмана продемонстрировала, что освобождение ниш легочных стволовых клеток является необходимым условием для успешной трансплантации предшественников легкого мыши или человека (Nature Medicine 2015). С этой целью они использовали первоначальную травму легких нафталином, которая вызвала немедленную стимуляцию эндогенных предшественников. Таким образом, в течение 48 часов делящиеся предшественники могут быть эффективно удалены путем облучения всего тела в дозе 6 Гр, что обеспечивает эффективное приживление предшественников донорских легких (рис. 1).

Рис. 1: Приживление и функциональное восстановление поврежденных легких эмбриональными клетками легких мыши. После повреждения легких с помощью NA и кондиционирования с помощью 6Gy TBI взрослым мышам C57BL/6 трансплантировали сингенные эмбриональные клетки легких на стадии E16 от доноров GFP+. ( а , б ) Репрезентативные двухфотонные микроскопические изображения с расширенным фокусом легких трансплантированных мышей через 6 недель после трансплантации, показывающие всю глубину сканирования сверху вниз химерного легкого без (а: z-стек 88 мкм) и с (b ) совместное окрашивание кровеносных сосудов с помощью квантовых точек (красный цвет) (полоса = 90 мкм). ( c ) Двухфотонное изображение с расширенным фокусом, показывающее всю глубину сканирования сверху вниз химерного легкого (z-stack 96 мкм) через 16 недель после трансплантации. ( d ) Двухфотонная микроскопия нетрансплантированного легкого мыши C57BL, показывающая фон (полоса = 90 мкм). (e, f, g) Репрезентативные изображения химерных легких, окрашенных анти-GFP (зеленый) и анти-AQP-5 (красный), что указывает на включение донорских альвеоцитов типа I в газообменную поверхность. (h, i, j) Химерное легкое, окрашенное анти-GFP (зеленый), анти-Sp-C антителами (синий), демонстрирует сурфактант донорского происхождения, продуцирующий альвеоциты II типа (столбики = 20 мкм). Все отдельные изображения, показанные выше, являются репрезентативными для n = 10 мышей, объединенных в результате 3 независимых экспериментов. (m, n) Измерения функции легких через 6 недель после трансплантации. (k, l) Окрашивание химерного легкого на CFTR (красный) и (GFP), демонстрирующее CFTR-положительные донорские клетки. (m) Исходное соответствие легких. Сравнение контрольных интактных мышей с мышами с повреждением легких (t-критерий Стьюдента, P<0,001) и мышей с повреждением легких с мышами, пересаженными после травмы (t-критерий Стьюдента, P=0,008). (n) Демпфирование тканей. Сравнение контрольных мышей с мышами с повреждением легких (t-тест Стьюдента, P = 0,015) и мышей с повреждением легких с мышами, пересаженными после травмы (t-критерий Стьюдента, P = 0,021). Значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего для 10–15 (n = 15 контрольных, n = 10 травмированных и n = 10 обработанных) мышей в каждой группе, объединенных в результате двух независимых экспериментов. нормальных мышей, мы предполагаем, что у пациентов с различными заболеваниями легких ниши легких могут быть уже частично истощены, и поэтому трансплантация может потребовать менее жесткого кондиционирования.

Цель. Охарактеризовать компартменты стволовых клеток в их нишах в различных клинических ситуациях (без патологии по сравнению с эмфизематозной и фиброзной легочной тканью) и оценить их пролиферативные свойства и свойства развития in vitro.

Дальнейшее внедрение системы легочных органоидных культур в скрининг лекарств и разработку персонализированной медицины для пациентов.

Методы Биопсия легочной ткани будет получена хирургическим путем: открытая биопсия легкого. Эта процедура обычно выполняется для гистологической диагностики фиброзных заболеваний. Пациенты с эмфиземой и терминальной стадией фиброзной болезни имеют более высокий риск развития рака легких. Большая часть пациентов с раком легкого, прошедших хирургическое лечение, имеют гистологический фон эмфиземы и фиброзного заболевания. Лобэктомия и пневмонэктомия часто выполняются как современные процедуры хирургического лечения рака легкого. Часть резецированной ткани легкого содержат эмфизематозные и фиброзные изменения или макроскопически и микроскопически выглядят нормальными. Эти «незлокачественные» участки будут взяты и сохранены в банке тканей Шиба для оценки вместе с образцами из фиброзных и эмфизематозных участков. Биопсии будут проанализированы с помощью иммуногистологии, FACS и 3D-органоидов (после удаления фибробластов) в лаборатории иммунологии Института Вейцмана.

Все Образцы будут собираться после подписания информированного согласия пациентов как в специальной форме информированного согласия для этого протокола, так и в форме банка тканей. У нас может быть до 3-4 пациентов в неделю. Собранные образцы будут подвергнуты резекции опытным персоналом либо из отделения торакальной хирургии, либо из отделения патологии (в соответствии с их должностной инструкцией в банке тканей). Свежие образцы будут доставлены в институт Вейцмана для FACS и IHC.

Поскольку о тканях легких человека имеется очень ограниченный объем знаний, необходимо будет тестировать легочные ткани здоровых и больных легких. Первоначально мы предлагаем тестировать 10-15 нормальных тканей легкого и 15-20 образцов больных тканей в течение 2 лет. Как упоминалось ранее, нормальные легочные ткани будут получены в виде «незлокачественных» участков у пациентов, перенесших лобэктомию/пневмонэктомию.