Definice stavu lidských plicních kmenových buněk ex vivo v tkáňových biopsiích prováděných u pacientů s emfyzémem a intersticiální fibrózou

Vědecké pozadí

Degenerativní plicní poruchy jsou výsledkem zánětlivých jevů, které končí destrukcí normální plicní architektury. Existují dva hlavní vzory:

1. Chronická obstrukční plicní nemoc (CHOPN) je hlavní příčinou morbidity a mortality. Očekává se, že do roku 2020 se stane třetí příčinou úmrtnosti po kardiovaskulárních poruchách a rakovině. Emfyzém je destruktivní formou CHOPN, protože alveolovaná tkáň mizí. Tento anatomický obraz není vždy homogenní a funkční poškození nesouvisí s rozsahem destrukce tkáně. Terapeutické eliminace zničené tkáně lze dosáhnout chirurgickým zákrokem nebo použitím různých blokovacích technik (snížení objemu plic).
2. Plicní fibróza (PF) je charakterizována abnormální reparací respiračního epitelu. K PF mohou vést různá onemocnění, jako jsou infekce, autoimunitní (poruchy pojivové tkáně), sarkoidóza, hypersenzitivní pneumonitida, pneumokonióza, histiocytóza X, lymfangioleiomyomatóza LAM atd. V mnoha situacích nelze určit vztah příčiny a účinku a onemocnění je idiopatická IPF.

Během posledních let se v různých medicínských oborech staly dostupné terapie založené na buňkách využívající progenitorové buňky a různé lešení. Plicní regenerační medicína se u těchto onemocnění v konečném stádiu jeví jako alternativa k transplantaci.

Avšak velmi složité buněčné složení plic, zahrnující více než 40 různých typů buněk, činí tento cíl náročným. Epiteliální výstelka dýchacího traktu, složená z vodivých a respiračních částí, se mění podél své proximo-distální osy. Dýchací cesty vedoucí z průdušnice do bronchiolů lidských plic sestávají z pseudostratifikovaného epitelu, který obsahuje stejné podíly bazálních buněk, sekrečních buněk a řasinkových buněk, stejně jako některé neuroendokrinní buňky. Nejmenší bronchioly, známé jako terminální a respirační bronchioly, jsou vystlány jednoduchým sloupcovým nebo kvádrovým epitelem obsahujícím sekreční a řasinkové buňky s menším počtem bazálních buněk. Epitely těchto vodivých dýchacích cest tvoří těsnou bariéru proti vnějšímu světu a jsou specializované na proces mukociliární clearance. Alveoly jsou lemovány alveolárními epiteliálními buňkami typu 1 a 2, dále nazývanými AT1 a AT2. Tyto buňky jsou také specializované na bariérovou funkci a extrémně tenké AEC1 sdílejí bazální membránu s okolní sítí plicních kapilár, aby se usnadnila difúze plynů mezi atmosférou a cirkulací.

Tato obecná distribuce typů epiteliálních buněk je zachována mezi lidmi a modelovými organismy, jako jsou hlodavci. Existují však výrazné rozdíly. Například přechod z pseudostratifikovaného do sloupcového epitelu se u hlodavců vyskytuje spíše proximálně, takže pseudostratifikovaným epitelem jsou vystlány pouze průdušnice a hlavní bronchy. Téměř všechny intralobární dýchací cesty u myší jsou lemovány jednoduchým sloupcovým nebo kvádrovým epitelem s několika bazálními buňkami. U myší je náhlý přechod z vedení dýchacích cest do alveol znám jako spojení broncho-alveolárních kanálků. U lidí terminální bronchioly vedou k respiračním bronchiolům, z nichž mnoho alveolárních kanálků končí nakonec v alveolech. Vzhledem k zásadní roli epiteliálního kompartmentu v plicích bylo vynaloženo velké úsilí na identifikaci epiteliálních kmenových a progenitorových buněk odpovědných za regenerační a reparační funkce.

Epiteliální progenitory sídlí v unikátním mikroprostředí neboli výklencích, reprezentovaných vaskulárními a mezenchymálními buňkami, které jsou bohatě inervovány. Tato architektura velmi připomíná výklenky HSM.

U myší bylo dosaženo značného pokroku směrem k identifikaci signálů, které regulují sebeobnovu a diferenciaci plicních epiteliálních kmenových buněk. Patří mezi ně Notch, Hippo/Yap, ROS/Nrf2, EGF, FGF, c-myb a cytokiny včetně IL-4, -13 a -6. Sousední epiteliální buňky, stromální buňky (včetně mezenchymálních buněk, fibroblastů, buněk hladkého svalstva a endotelu) a imunitní buňky představují potenciální zdroje těchto faktorů. Odlišné niky kmenových buněk byly definovány v průdušnici a plicích dospělých myší v ustáleném stavu a přibývá důkazů, že za různých patologických stavů jsou niky kmenových buněk ovlivněny a změněny.

Velmi málo je známo o kmenových buňkách a výklencích kmenových buněk v plicích dospělého člověka a signálech, které regulují udržování homeostázy plicní tkáně ve zdraví a nemoci.

Nedávno Reisnerova skupina ve Weizmannově institutu prokázala, že uvolnění nik plicních kmenových buněk je předpokladem pro úspěšnou transplantaci myších nebo lidských plicních progenitorů (Nature Medicine 2015). Za tímto účelem použili počáteční poranění plic naftalenem, které spustilo okamžitou stimulaci endogenních progenitorů. Během 48 hodin tak mohly být dělící se progenitory účinně odstraněny 6 Gy ozářením celého těla, což umožnilo efektivní přihojení dárcovských plicních progenitorů (obr. 1).

Obr. 1: Přihojení a funkční oprava poraněných plic myšími embryonálními plicními buňkami. Po poranění plic NA a kondicionování pomocí 6Gy TBI byly dospělým myším C57BL/6 transplantovány syngenní embryonální plicní buňky ve stádiu E16 od dárců GFP+. (a, b) Reprezentativní dvoufotonové mikroskopické snímky s rozšířeným ohniskem plic transplantovaných myší 6 týdnů po transplantaci, ukazující celou hloubku skenování shora dolů chimérické plíce, bez (a: z-stack 88μm) as (b ) společné barvení krevních cév pomocí kvantových teček (červená) (sloupec=90μm). (c) Dvoufotonový snímek rozšířeného ohniska, ukazující celou hloubku skenování od shora dolů chimérické plíce (z-stack 96 μm) 16 týdnů po transplantaci. (d) Dvoufotonová mikroskopie netransplantovaných plic myši C57BL ukazující pozadí (sloupec = 90 μm). (e,f,g) Reprezentativní snímky chimérických plic obarvených anti-GFP (zelená) a anti-AQP-5 (červená), což ukazuje na začlenění alveocytů typu I odvozených od dárce do povrchu výměny plynů. (h,i,j) Chimérické plíce obarvené anti-GFP (zelená), anti-Sp-C protilátkami (modrá), prokazující dárcovskou povrchově aktivní látku produkující alveocyty typu II (sloupce=20μm). Všechny jednotlivé obrázky uvedené výše jsou reprezentativní pro n=10 myší shromážděných ze 3 nezávislých experimentů. (m,n) Měření funkce plic 6 týdnů po transplantaci. (k,l) Barvení chimérických plic na CFTR (červená) a (GFP), prokazující CFTR pozitivní dárcovské buňky. (m) Poddajnost základní linie plic. Porovnání kontrolních intaktních myší vs. myší s poraněním plic (Studentův t-test, P<0,001) a myší s poraněním plic vs. myší transplantovaných po poranění (Studentův t-test, P=0,008). (n) Tkáňové tlumení. Porovnání kontrolních myší vs. myší s poraněním plic (Studentův t-test, P=0,015) a myší s poraněním plic vs. myší transplantovaných po poranění (Studentův t-test, P=0,021). Hodnoty jsou průměry ± SEM 10-15 (n=15 kontrolních, n=10 zraněných a n=10 ošetřených) myší v každé skupině shromážděných ze dvou nezávislých experimentů. Toto kondicionování však bylo nutné pro umožnění účinného přihojení dárcovských plicních progenitorů v normální myši, předpokládáme, že u pacientů s různými plicními chorobami mohou být plicní niky již částečně vyčerpané, a proto může transplantace vyžadovat méně závažnou přípravu.

Cíl Charakterizovat kompartmenty kmenových buněk v jejich nikách v různých klinických situacích (neonemocněných ve srovnání s emfyzematózní a fibrotickou plicní tkání) a posoudit jejich proliferační a vývojové vlastnosti in vitro.

Dále implementovat systém kultivace plicních organoidů při screeningu léků a vývoji personalizované medicíny pro pacienty.

Metody Biopsie plicní tkáně budou získány chirurgickými postupy: otevřené plicní biopsie. Tento postup se běžně provádí při histologické diagnostice fibrotických onemocnění. U pacientů s emfyzémem a konečným stádiem fibrotického onemocnění je vyšší riziko vzniku rakoviny plic. Velká část chirurgicky léčených pacientů s rakovinou plic má jako histologické pozadí emfyzém a fibrotické onemocnění. Lobektomie a pneumonektomie jsou často prováděny jako nejmodernější postupy v chirurgické léčbě rakoviny plic. Část resekované plicní tkáně obsahuje emfyzematózní a fibrotické změny nebo vypadá makroskopicky a mikroskopicky normálně. Tyto „nerakovinné“ oblasti budou odebrány a uchovány v tkáňové bance Sheba pro hodnocení spolu se vzorky z fibrotických a emfyzematózních oblastí. Biopsie budou analyzovány imunohistologicky, FACS a 3D organoidy (po odstranění fibroblastů) v imunologické laboratoři Weizmannova institutu.

Všechny Vzorky budou odebrány po podpisu informovaného souhlasu pacientů jak na určeném formuláři informovaného souhlasu pro tento protokol, tak na formuláři tkáňové banky. Můžeme mít až 3-4 pacienty/týden. Odebrané vzorky budou resekovány zkušeným personálem buď z oddělení hrudní chirurgie nebo oddělení patologie (v rámci pracovní náplně v Tkáňové bance). Čerstvé vzorky budou převezeny do Weizmannova ústavu na FACS a IHC.

Protože existují velmi omezené znalosti o lidských plicních tkáních, bude povinné testovat plicní tkáně ze zdravých a nemocných plic. Zpočátku doporučujeme testovat 10-15 normálních plicních tkání a 15-20 nemocných vzorků během období 2 let. Jak bylo uvedeno výše, normální plicní tkáně budou získány jako "nerakovinové" oblasti od pacientů podstupujících lobektomie/pneumonektomie.