Ihmisen keuhkojen kantasolujen tilan määritelmä ex vivo kudosbiopsioissa, jotka on suoritettu potilaille, joilla on emfyseema ja interstitiaalinen fibroosi

Tieteellinen tausta

Degeneratiiviset keuhkosairaudet ovat seurausta tulehdustapahtumista, jotka päättyvät normaalin keuhkorakenteen tuhoutumiseen. On olemassa kaksi päämallia:

1. Krooninen obstruktiivinen keuhkosairaus (COPD) on merkittävä sairastuvuuden ja kuolleisuuden syy. Vuoteen 2020 asti sen odotetaan olevan kolmas kuolinsyy sydän- ja verisuonisairauksien ja syövän jälkeen. Emfyseema on keuhkoahtaumataudin tuhoava muoto, kun alveoloitu kudos katoaa. Tämä anatominen kuvio ei ole aina homogeeninen eikä toimintahäiriö liity kudostuhojen laajuuteen. Tuhoutuneen kudoksen terapeuttinen eliminointi voidaan saavuttaa leikkauksella tai käyttämällä erilaisia ​​estotekniikoita (keuhkojen tilavuuden vähentäminen).
2. Keuhkofibroosille (PF) on tunnusomaista hengitysteiden epiteelin epänormaali korjautuminen. Useat sairaudet voivat johtaa PF:ään, kuten infektiot, autoimmuuni (sidekudossairaudet), sarkoidoosi, yliherkkyyskeuhkotulehdus, pneumokonioosi, histiosytoosi X, lymfangioleiomyomatoosi LAM jne. Monissa tilanteissa syy-seuraussuhdetta ei voida tunnistaa ja sairaus on idiopaattinen IPF.

Viime vuosien aikana solupohjaisia ​​hoitoja, joissa käytetään kantasoluja ja erilaisia ​​tukirakenteita, on tullut saataville useilla lääketieteen aloilla. Keuhkojen regeneratiivinen lääketiede näyttää olevan vaihtoehto elinsiirrolle näissä loppuvaiheen sairauksissa.

Kuitenkin keuhkojen erittäin monimutkainen solukoostumus, joka käsittää yli 40 eri solutyyppiä, tekee tästä tavoitteesta haastavan. Hengitysteiden epiteelivuori, joka koostuu johtavista ja hengitysosista, vaihtelee proximo-distaalista akseliaan pitkin. Henkitorvesta ihmisen keuhkojen keuhkoputkiin johtavat hengitystiet koostuvat pseudostratifioituneesta epiteelistä, joka sisältää yhtä suuret osuudet tyvisoluja, erityssoluja ja väresoluja sekä joitakin neuroendokriinisia soluja. Pienimmät keuhkoputket, jotka tunnetaan terminaaleina ja hengityskeuhkoputkina, on vuorattu yksinkertaisella pylväsmäisellä tai kuutiomaisella epiteelillä, joka sisältää erittäviä ja värekarvaisia ​​soluja, joissa on vähemmän tyvisoluja. Näiden johtavien hengitysteiden epiteeli muodostaa tiukan esteen ulkomaailmaa vastaan ​​ja on erikoistunut mukosiliaariseen puhdistumaprosessiin. Alveoleja reunustavat tyypin 1 ja 2 alveolaariset epiteelisolut, joita kutsutaan tämän jälkeen AT1:ksi ja AT2:ksi. Nämä solut ovat myös erikoistuneet sulkutoimintoihin, ja erittäin ohuilla AEC1:illä on yhteinen tyvikalvo ympäröivän keuhkokapillaariverkoston kanssa kaasujen diffuusiota ilmakehän ja kierron välillä.

Tämä epiteelisolutyyppien yleinen jakauma on säilynyt ihmisten ja malliorganismien, kuten jyrsijöiden, välillä. On kuitenkin huomattavia eroja. Esimerkiksi siirtyminen pseudostratifioituneesta pylväsepiteelistä tapahtuu proksimaalisesti jyrsijöillä, joten vain henkitorvi ja runkokeuhkoputket ovat vuorattu pseudostratifioidulla epiteelillä. Melkein kaikki hiirten intralobaariset hengitystiet on vuorattu yksinkertaisella pylväsmäisellä tai kuutiomaisella epiteelillä, jossa on vähän tyvisoluja. Hiirillä äkillinen siirtyminen johtavasta hengitystiestä keuhkorakkuloihin tunnetaan bronko-alveolaarisen tiehyen liitoksena. Ihmisillä terminaaliset keuhkoputket synnyttävät hengityskeuhkoputkia, joista monet alveolaariset tiehyet päättyvät lopulta alveoleihin. Ottaen huomioon epiteeliosaston keskeisen roolin keuhkoissa, on tehty paljon työtä epiteelin kanta- ja progenitorisolujen tunnistamiseksi, jotka vastaavat regeneratiivisista ja korjaavista toiminnoista.

Epiteelin progenitorit asuvat ainutlaatuisessa mikroympäristössä tai markkinarakoissa, joita edustavat verisuoni- ja mesenkymaaliset solut, jotka ovat runsaasti hermotettuja. Tämä arkkitehtuuri muistuttaa suuresti HSM-rakoja.

Hiirillä on saavutettu huomattavaa edistystä sellaisten signaalien tunnistamisessa, jotka säätelevät keuhkojen epiteelin kantasolujen uusiutumista ja erilaistumista. Näitä ovat Notch, Hippo/Yap, ROS/Nrf2, EGF, FGF, c-myb ja sytokiinit, mukaan lukien IL-4, -13 ja -6. Viereiset epiteelisolut, stroomasolut (mukaan lukien mesenkymaaliset solut, fibroblastit, sileät lihassolut ja endoteeli) ja immuunisolut ovat kaikki näiden tekijöiden mahdollisia lähteitä. Aikuisen hiiren henkitorvessa ja keuhkoissa vakaassa tilassa on määritelty selkeät kantasolurakenteet, ja on yhä enemmän todisteita siitä, että erilaisissa patologisissa olosuhteissa kantasolujen markkinaraot vaikuttavat ja muuttuvat.

Hyvin vähän tiedetään ihmisen aikuisen keuhkoissa olevista kantasoluista ja kantasoluista ja signaaleista, jotka säätelevät keuhkokudoksen homeostaasin ylläpitämistä terveydellä ja sairauksissa.

Äskettäin Weizmann-instituutin Reisner-ryhmä on osoittanut, että keuhkojen kantasolujen tyhjentäminen on ennakkoedellytys hiiren tai ihmisen keuhkojen progenitorien onnistuneelle siirrolle (Nature Medicine 2015). Tätä varten he käyttivät ensimmäistä keuhkovauriota naftaleenilla, joka laukaisi endogeenisten esisolujen välittömän stimulaation. Siten jakautuvat progenitorit voitiin poistaa tehokkaasti 48 tunnin sisällä 6 Gy:n kokonaiskehon säteilytyksellä, mikä mahdollisti luovuttajan keuhkojen progenitorien tehokkaan kiinnittymisen (kuvio 1).

Kuva 1: Vaurioituneiden keuhkojen istutus ja toiminnallinen korjaus hiiren alkion keuhkosoluilla. NA:lla tehdyn keuhkovaurion ja 6Gy TBI:n kanssa ehdoinnoinnin jälkeen aikuisille C57BL/6-hiirille siirrettiin syngeenisiä E16-vaiheen alkion keuhkosoluja GFP+-luovuttajilta. (a, b) Edustavat kahden fotonimikroskoopin laajennetut tarkennuskuvat siirrettyjen hiirten keuhkoista 6 viikkoa siirron jälkeen, jotka osoittavat koko skannaussyvyyden kimeerisen keuhkon ylhäältä alas, ilman (a: z-pino 88 μm) ja (b) kanssa ) verisuonten yhteisvärjäys kvanttipisteillä (punainen) (bar = 90 μm). (c) Kahden fotonin laajennettu tarkennuskuva, joka näyttää koko skannaussyvyyden kimeerisen keuhkon ylhäältä alas (z-pino 96 μm) 16 viikkoa transplantaation jälkeen. (d) Kahden fotonin mikroskopia siirtämättömästä C57BL-hiiren keuhkosta, jossa näkyy tausta (bar = 90 μm). (e, f, g) Edustavia kuvia kimeerisistä keuhkoista, jotka on värjätty anti-GFP:llä (vihreä) ja anti-AQP-5 (punainen), mikä osoittaa luovuttajaperäisten tyypin I alveosyyttien liittymisen kaasunvaihtopintaan. (h, i, j) Kimeeriset keuhkot, jotka on värjätty anti-GFP:llä (vihreä), anti-Sp-C-vasta-aineilla (sininen), osoittaen luovuttajaperäisiä pinta-aktiivisia aineita, jotka tuottavat tyypin II alveosyyttejä (pylväät = 20 μm). Kaikki yllä esitetyt yksittäiset kuvat edustavat n = 10 hiirtä, jotka on yhdistetty 3 riippumattomasta kokeesta. (m, n) Keuhkojen toimintamittaukset 6 viikkoa transplantaation jälkeen. (k,l) Kimeerisen keuhkon värjäys CFTR:lle (punainen) ja (GFP), joka osoittaa CFTR-positiivisia luovuttajasoluja. (m) Keuhkojen perustason noudattaminen. Vertailu ehjien kontrollihiirten vs. hiirten, joilla on keuhkovaurio (Studentin t-testi, P < 0,001) ja keuhkovaurioita sairastavien hiirten vertailu vaurion jälkeen siirrettyihin hiiriin (Studentin t-testi, P = 0,008). n) Kudosten vaimennus. Vertailu kontrollihiirten vs hiirten, joilla on keuhkovaurio (Studentin t-testi, P = 0,015), ja hiirten, joilla on keuhkovaurio, vertailu vaurion jälkeen siirrettyihin hiiriin (Studentin t-testi, P = 0,021). Arvot ovat keskiarvoja ± SEM 10-15 hiirestä (n = 15 kontrollia, n = 10 loukkaantunutta ja n = 10 hoidettua) hiirtä kussakin ryhmässä, jotka on yhdistetty kahdesta riippumattomasta kokeesta. Vaikka tämä ehdollistaminen vaadittiin, jotta luovuttajan keuhkojen progenitorit voidaan istuttaa tehokkaasti Normaalit hiiret, kuvittelemme, että potilailla, joilla on erilaisia ​​keuhkosairauksia, keuhkoraot voivat olla jo osittain tyhjentyneet ja siksi elinsiirto saattaa vaatia vähemmän vakavaa hoitoa.

Tavoite Karakterioida kantasoluosastoja niiden nicheissä erilaisissa kliinisissä tilanteissa (sairaat verrattuna emfyseematoimaan ja fibroottiseen keuhkokudokseen) ja arvioida niiden proliferatiivisia ja kehitysominaisuuksia in vitro.

Edelleen toteuttaa keuhkojen organoidiviljelyjärjestelmää lääkeseulonnassa ja potilaalle räätälöidyn lääketieteen kehittämisessä.

Menetelmät Keuhkokudoksen biopsiat otetaan kirurgisilla toimenpiteillä: avoimilla keuhkobiopsioilla. Tämä toimenpide suoritetaan rutiininomaisesti fibroottisten sairauksien histologiseen diagnoosiin. Potilailla, joilla on emfyseema ja loppuvaiheen fibroottinen sairaus, on suurempi riski saada keuhkosyöpä. Suurella osalla kirurgisesti hoidetuista keuhkosyöpäpotilaista histologisena taustana on emfyseema ja fibroottinen sairaus. Lobektomia ja pneumonektomia suoritetaan usein tekniikan tason menetelminä keuhkosyövän kirurgisessa hoidossa. Osa resektoidusta keuhkokudoksesta sisältää emfyseemattisia ja fibroottisia muutoksia tai näyttää makroskooppisesti ja mikroskooppisesti normaalilta. Näistä "ei-syöpää sisältävistä" alueista otetaan näytteitä ja niitä säilytetään Sheba Tissue Bankissa arvioitavaksi yhdessä fibroottisten ja emfyseemaavien alueiden näytteiden kanssa. Biopsiat analysoidaan immunohistologialla, FACS:lla ja 3D-organoideilla (fibroblastien poiston jälkeen) Weizmann Instituten immunologialaboratoriossa.

Kaikki näytteet otetaan sen jälkeen, kun potilaat ovat allekirjoittaneet tietoisen suostumuksen sekä tälle protokollalle tarkoitetulla tietoisen suostumuslomakkeella että kudospankkilomakkeella. Meillä voi olla jopa 3-4 potilasta viikossa. Kerätyt näytteet resektio kokenut henkilökunta joko rintakirurgian osastolta tai patologian osastolta (osana heidän toimenkuvaansa kudospankissa). Tuoreet näytteet kuljetetaan Weizmann-instituuttiin FACS- ja IHC-tutkimukseen.

Koska ihmisen keuhkokudoksesta on hyvin vähän tietoa, terveiden ja sairaiden keuhkojen keuhkokudokset on testattava. Aluksi suosittelemme 10-15 normaalin keuhkokudoksen ja 15-20 sairaan näytteen testaamista 2 vuoden aikana. Kuten edellä mainittiin, normaalit keuhkokudokset saadaan "ei-syöpää aiheuttavina" alueina potilailta, joille tehdään lobektomia/pneumonektomia.