폐기종 및 간질성 섬유증 환자에서 수행된 조직 생검에서 인간 폐 줄기 세포 틈새 ex Vivo의 상태 정의

과학적 배경

퇴행성 폐 장애는 정상적인 폐 구조의 파괴로 끝나는 염증 사건의 결과입니다. 두 가지 주요 패턴이 있습니다.

1. 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)은 이환율과 사망률의 주요 원인입니다. 2020년까지 심혈관 질환과 암에 이어 세 번째 사망 원인이 될 것으로 예상됩니다. 폐기종은 폐포된 조직이 사라지는 COPD의 파괴적인 형태입니다. 이 해부학적 패턴은 항상 동질적이지 않으며 기능 장애가 조직 파괴의 정도와 연결되지 않습니다. 파괴된 조직의 치료적 제거는 수술이나 다양한 차단 기술(Lung Volume Reduction)을 사용하여 달성할 수 있습니다.
2. 폐 섬유증(PF)은 호흡기 상피의 비정상적인 복구를 특징으로 합니다. 감염, 자가면역(결합 조직 장애), 유육종증, 과민성 폐렴, 진폐증, 조직구증 X, 림프관평활근종증 LAM 등과 같은 다양한 질병이 PF를 유발할 수 있습니다. 많은 상황에서 원인 결과 관계를 확인할 수 없으며 질병은 특발성 IPF입니다.

지난 몇 년 동안 전구 세포와 다양한 스캐폴드를 사용하는 세포 기반 치료법이 다양한 의료 분야에서 이용 가능해졌습니다. 폐 재생 의학은 이러한 말기 질환에서 이식의 대안으로 보입니다.

그러나 40개 이상의 서로 다른 세포 유형을 포함하는 폐의 매우 복잡한 세포 구성으로 인해 이 목표를 달성하기가 어렵습니다. 전도 부분과 호흡 부분으로 구성된 기도의 상피 안감은 근위-원위 축을 따라 다양합니다. 인간 폐의 기관에서 세기관지까지의 전도 기도는 동일한 비율의 기저 세포, 분비 세포 및 섬모 세포뿐만 아니라 일부 신경 내분비 세포를 포함하는 가성중층 상피로 구성됩니다. 말단 및 호흡 세기관지로 알려진 가장 작은 세기관지는 기저 세포가 적은 분비 및 섬모 세포를 포함하는 단순한 원주형 또는 입방형 상피로 늘어서 있습니다. 이러한 전도성 기도의 상피는 외부 세계에 대해 단단한 장벽을 형성하고 점액 섬모 청소 과정에 특화되어 있습니다. 폐포는 이후에 각각 AT1 및 AT2라고 하는 유형 1 및 2 폐포 상피 세포에 의해 늘어서 있습니다. 이 세포는 또한 장벽 기능에 특화되어 있으며 매우 얇은 AEC1은 대기와 순환 사이의 가스 확산을 촉진하기 위해 주변 폐 모세 혈관 네트워크와 기저막을 공유합니다.

상피 세포 유형의 이러한 일반적인 분포는 설치류와 같은 모델 유기체와 인간 사이에 보존됩니다. 그러나 눈에 띄는 차이점이 있습니다. 예를 들어 가성중층 상피에서 원주 상피로의 전이는 설치류에서 더 근접하게 발생하므로 기관 및 주기관지에만 가성중층 상피가 늘어서 있습니다. 생쥐의 거의 모든 엽내 기도는 기저 세포가 거의 없는 단순한 원주형 또는 입방형 상피로 늘어서 있습니다. 생쥐에서 전도성 기도에서 폐포로의 갑작스러운 전이는 기관지-폐포관 접합부로 알려져 있습니다. 인간의 경우 말단 세기관지는 많은 폐포관이 궁극적으로 폐포에서 끝나는 호흡 세기관지를 발생시킵니다. 폐에서 상피 구획의 필수적인 역할을 고려하여 재생 및 회복 기능을 담당하는 상피 줄기 및 전구 세포를 식별하기 위해 많은 노력이 이루어졌습니다.

상피 전구체는 풍부한 신경분포가 있는 혈관 및 중간엽 세포로 대표되는 독특한 미세 환경 또는 틈새에 상주합니다. 이 아키텍처는 HSM 틈새와 매우 유사합니다.

폐 상피 줄기 세포 자가 재생 및 분화를 조절하는 신호를 확인하는 데 마우스에서 상당한 진전이 있었습니다. 여기에는 Notch, Hippo/Yap, ROS/Nrf2, EGF, FGF, c-myb 및 IL-4, -13 및 -6을 포함한 사이토카인이 포함됩니다. 인접한 상피 세포, 간질 세포(중간엽 세포, 섬유아세포, 평활근 세포 및 내피 포함) 및 면역 세포는 모두 이러한 요인의 잠재적인 출처를 나타냅니다. 뚜렷한 줄기 세포 틈새는 정상 상태의 성인 마우스 기관 및 폐에서 정의되었으며 다양한 병리학적 조건에서 줄기 세포 틈새가 영향을 받고 변경된다는 증거가 증가하고 있습니다.

인간 성인 폐의 줄기 세포 및 줄기 세포 적소와 건강 및 질병에서 폐 조직 항상성의 유지를 조절하는 신호에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.

최근 Weizmann Institute의 Reisner 그룹은 폐 줄기 세포 적소를 비우는 것이 마우스 또는 인간 폐 전구체의 성공적인 이식을 위한 전제 조건임을 입증했습니다(Nature Medicine 2015). 이를 위해 그들은 내인성 선조의 즉각적인 자극을 유발하는 나프탈렌으로 초기 폐 손상을 사용했습니다. 따라서 48시간 이내에 분할 전구체는 기증자 폐 전구체의 효과적인 생착을 가능하게 하는 6 Gy 전신 조사에 의해 효과적으로 제거될 수 있었습니다(그림 1).

그림 1: 마우스 배아 폐 세포에 의한 손상된 폐의 생착 및 기능 복구. NA에 의한 폐 손상 및 6Gy TBI에 의한 컨디셔닝 후, C57BL/6 성체 마우스에 GFP+ 공여자로부터의 동계 E16 단계 배아 폐 세포를 이식하였다. ( a, b ) 대표적인 2광자 현미경은 이식 6주 후 이식된 마우스의 폐의 초점 이미지를 확장하여 (a: z-스택 88μm) 없이 키메라 폐의 위에서 아래로 전체 스캔 깊이를 보여줍니다. ) 양자점(빨간색)으로 혈관을 공동 염색(bar=90μm). (c) 이식 16주 후 키메라 폐(z-스택 96μm)의 위에서 아래로 전체 스캔 깊이를 보여주는 2광자 확장 초점 이미지. (d) 배경을 보여주는 이식되지 않은 C57BL 마우스 폐의 2광자 현미경 검사(막대 = 90μm). (e,f,g) 항-GFP(녹색) 및 항-AQP-5(적색)로 염색된 키메라 폐의 대표적인 이미지로, 기증자 유래 I형 폐포세포가 가스 교환 표면에 통합되었음을 나타냅니다. (h,i,j) 항-GFP(녹색), 항-Sp-C 항체(파란색)로 염색된 키메라 폐, 기증자 유래 계면활성제 생성 유형 II 폐포세포(막대 = 20μm)를 보여줍니다. 위에 표시된 모든 개별 이미지는 3개의 독립적인 실험에서 풀링된 n=10 마우스를 대표합니다. (m,n) 이식 6주 후 폐 기능 측정. ( k, l ) CFTR (빨간색) 및 (GFP)에 대한 키메라 폐의 염색, CFTR 양성 기증자 세포를 보여줍니다. (m) 폐 기준 준수. 대조군 무손상 마우스 대 폐 손상 마우스(Student's t-test, P<0.001) 및 폐 손상 마우스 대 손상 후 이식된 마우스의 비교(Student's t-test, P=0.008). (n) 조직 댐핑. 대조군 마우스 대 폐 손상 마우스(Student's t-test, P=0.015) 및 폐 손상 마우스 대 손상 후 이식된 마우스의 비교(Student's t-test, P=0.021). 값은 두 개의 독립적인 실험에서 풀링된 각 그룹의 10-15(n=15 대조군, n=10 손상 및 n=10 치료) 마우스의 평균 ± SEM입니다. 정상 생쥐의 경우 다른 폐 질환이 있는 환자의 경우 폐 틈새가 이미 부분적으로 고갈되었을 수 있으므로 이식에 덜 심각한 조건이 필요할 수 있습니다.

목적 다양한 임상 상황(기종성 및 섬유성 폐 조직과 비교하여 질병이 없음)에서 틈새에 있는 줄기 세포 구획을 특성화하고 시험관 내에서 증식 및 발달 특성을 평가합니다.

약물 스크리닝 및 환자 맞춤형 의학 개발에서 폐 오가노이드 배양 시스템을 추가로 구현합니다.

방법 폐 조직의 생검은 외과적 절차: 개방형 폐 생검에 의해 얻어질 것입니다. 이 절차는 섬유성 질환의 조직학적 진단을 위해 일상적으로 수행됩니다. 폐기종 및 말기 섬유성 질환이 있는 환자는 폐암 발병 위험이 더 높습니다. 외과적으로 치료받은 폐암 환자의 많은 비율이 조직학적 배경으로 폐기종과 섬유성 질환을 가지고 있습니다. 폐엽절제술과 전폐절제술은 폐암 수술 관리에서 최첨단 절차로 자주 시행됩니다. 절제된 폐 조직의 일부는 폐기종 및 섬유성 변화를 포함하거나 육안 및 현미경으로 정상으로 보입니다. 이러한 "암이 아닌" 영역은 섬유화 및 폐기종 영역의 샘플과 함께 평가를 위해 Sheba Tissue Bank에서 샘플링 및 보존됩니다. 생검은 Weizmann Institute의 면역학 실험실에서 면역조직학, FACS 및 3D 오가노이드(섬유아세포 제거 후)로 분석됩니다.

모든 샘플은 이 프로토콜에 대해 지정된 사전 동의서 양식과 조직 은행 양식 모두에서 환자의 사전 동의 서명에 따라 수집됩니다. 주당 3-4명의 환자가 있을 수 있습니다. 수집된 샘플은 흉부외과 부서 또는 병리과 부서의 숙련된 직원에 의해 절제됩니다(조직 은행에서 직무 설명의 일부로). 신선한 샘플은 FACS 및 IHC를 위해 Weizmann 연구소로 이송됩니다.

인간의 폐 조직에 대한 지식이 매우 제한되어 있기 때문에 건강하고 병든 폐의 폐 조직을 테스트하는 것이 필수적입니다. 처음에 우리는 2년 동안 10-15개의 정상 폐 조직과 15-20개의 질병 샘플을 검사할 것을 제안합니다. 앞서 언급한 바와 같이 정상적인 폐 조직은 폐엽절제술/폐폐절제술을 받는 환자로부터 "비암성" 영역으로 얻을 수 있습니다.