Definizione dello stato delle nicchie di cellule staminali polmonari umane ex vivo nelle biopsie tissutali eseguite in pazienti con enfisema e fibrosi interstiziale

Sfondo scientifico

Le malattie polmonari degenerative sono il risultato di eventi infiammatori che si concludono con la distruzione della normale architettura polmonare. Esistono due modelli principali:

1. La broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) è una delle principali cause di morbilità e mortalità. Fino al 2020 si prevede che diventerà la terza causa di mortalità dopo i disturbi cardiovascolari e il cancro. L'enfisema è la forma distruttiva della BPCO quando il tessuto alveolato scompare. Questo modello anatomico non è sempre omogeneo e la compromissione funzionale non è collegata all'entità della distruzione tissutale. L'eliminazione terapeutica del tessuto distrutto può essere ottenuta mediante intervento chirurgico o utilizzando varie tecniche di blocco (riduzione del volume polmonare).
2. La fibrosi polmonare (PF) è caratterizzata da una riparazione anomala dell'epitelio respiratorio. Varie malattie possono provocare PF come infezioni, autoimmuni (disturbi del tessuto connettivo), sarcoidosi, polmonite da ipersensibilità, pneumoconiosi, istiocitosi X, linfangioleiomiomatosi LAM ecc. In molte situazioni non è possibile identificare una relazione causa effetto e la malattia è IPF idiopatica.

Negli ultimi anni le terapie cellulari che utilizzano cellule progenitrici e vari scaffold sono diventate disponibili in vari campi medici. La medicina rigenerativa polmonare sembra essere un'alternativa al trapianto in queste malattie allo stadio terminale.

Tuttavia, la composizione cellulare molto complessa del polmone, comprendente più di 40 diversi tipi di cellule, rende questo obiettivo impegnativo. Il rivestimento epiteliale del tratto respiratorio, composto da parti conduttrici e respiratorie, varia lungo il suo asse prossimo-distale. Le vie aeree di conduzione dalla trachea ai bronchioli dei polmoni umani sono costituite da epitelio pseudostratificato, comprendente proporzioni uguali di cellule basali, cellule secretorie e cellule ciliate, nonché alcune cellule neuroendocrine. I bronchioli più piccoli, noti come bronchioli terminali e respiratori, sono rivestiti da un semplice epitelio colonnare o cuboidale contenente cellule secretorie e ciliate con meno cellule basali. Gli epiteli di queste vie aeree di conduzione formano una stretta barriera contro il mondo esterno e sono specializzati per il processo di clearance mucociliare. Gli alveoli sono rivestiti da cellule epiteliali alveolari di tipo 1 e 2, chiamate rispettivamente AT1 e AT2. Queste cellule sono anche specializzate per la funzione di barriera e le AEC1 estremamente sottili condividono una membrana basale con la rete circostante di capillari polmonari per facilitare la diffusione dei gas tra l'atmosfera e la circolazione.

Questa distribuzione generale dei tipi di cellule epiteliali è conservata tra gli esseri umani e gli organismi modello come i roditori. Tuttavia, ci sono notevoli differenze. Ad esempio, la transizione da un epitelio pseudostratificato a colonnare avviene più prossimalmente nei roditori, quindi solo la trachea e i bronchi principali sono rivestiti da un epitelio pseudostratificato. Quasi tutte le vie aeree intralobari nei topi sono rivestite da un semplice epitelio colonnare o cuboidale con poche cellule basali. Nei topi, la brusca transizione da una via aerea conduttrice agli alveoli è nota come giunzione del dotto bronco-alveolare. Nell'uomo, i bronchioli terminali danno origine ai bronchioli respiratori da cui molti dotti alveolari terminano infine negli alveoli. Considerando il ruolo essenziale del compartimento epiteliale nel polmone, sono stati fatti molti sforzi per identificare le cellule staminali e progenitrici epiteliali responsabili delle funzioni rigenerative e riparative.

I progenitori epiteliali risiedono in microambiente o nicchie unici, rappresentati da cellule vascolari e mesenchimali, che sono riccamente innervate. Questa architettura ricorda molto le nicchie HSM.

Sono stati compiuti notevoli progressi nei topi verso l'identificazione dei segnali che regolano l'auto-rinnovamento e la differenziazione delle cellule staminali epiteliali polmonari. Questi includono Notch, Hippo/Yap, ROS/Nrf2, EGF, FGF, c-myb e citochine tra cui IL-4, -13 e -6. Le cellule epiteliali adiacenti, le cellule stromali (comprese le cellule mesenchimali, i fibroblasti, le cellule muscolari lisce e l'endotelio) e le cellule immunitarie rappresentano tutte potenziali fonti di questi fattori. Sono state definite nicchie distinte di cellule staminali nella trachea e nel polmone del topo adulto allo stato stazionario e vi sono prove crescenti che in diverse condizioni patologiche le nicchie di cellule staminali sono interessate e alterate.

Si sa molto poco sulle cellule staminali e sulle nicchie di cellule staminali nel polmone umano adulto e sui segnali che regolano il mantenimento dell'omeostasi del tessuto polmonare in salute e in malattia.

Recentemente, il gruppo Reisner del Weizmann Institute ha dimostrato che liberare le nicchie di cellule staminali polmonari è un prerequisito per il successo del trapianto di progenitori polmonari murini o umani (Nature Medicine 2015). A tal fine, hanno utilizzato una lesione polmonare iniziale con naftalene che ha innescato un'immediata stimolazione dei progenitori endogeni. Pertanto, entro 48 ore, i progenitori in divisione potrebbero essere efficacemente ablati mediante irradiazione corporea totale di 6 Gy, consentendo un efficace attecchimento dei progenitori polmonari del donatore (Fig.1).

Fig. 1: Attecchimento e riparazione funzionale dei polmoni danneggiati da cellule polmonari embrionali di topo. A seguito di lesioni polmonari con NA e condizionamento con 6Gy TBI, topi adulti C57BL/6 sono stati trapiantati con cellule polmonari embrionali singeniche in stadio E16 da donatori GFP+. (a, b) La microscopia rappresentativa a due fotoni ha esteso le immagini a fuoco dei polmoni dei topi trapiantati 6 settimane dopo il trapianto, mostrando l'intera profondità di scansione dall'alto verso il basso del polmone chimerico, senza (a: z-stack 88μm) e con (b ) co-colorazione dei vasi sanguigni con Quantum dots (rosso) (bar=90μm). (c) Immagine a fuoco esteso a due fotoni, che mostra l'intera profondità di scansione dall'alto verso il basso del polmone chimerico (stack z 96 μm) 16 settimane dopo il trapianto. ( d ) Microscopia a due fotoni del polmone di topo C57BL non trapiantato che mostra lo sfondo (barra = 90 μm). ( e, f, g ) Immagini rappresentative di polmoni chimerici colorati con anti-GFP (verde) e anti-AQP-5 (rosso), che indicano l'incorporazione di alveociti di tipo I derivati ​​​​da donatori nella superficie di scambio di gas. ( h, i, j ) Polmone chimerico colorato con anticorpi anti-GFP (verde), anti-Sp-C (blu), che dimostrano alveociti di tipo II che producono tensioattivo derivato dal donatore (barre = 20 μm). Tutte le singole immagini mostrate sopra sono rappresentative di n=10 topi riuniti da 3 esperimenti indipendenti. (m, n) Misurazioni della funzionalità polmonare 6 settimane dopo il trapianto. ( k, l ) Colorazione del polmone chimerico per CFTR (rosso) e (GFP), a dimostrazione di cellule donatrici positive al CFTR. (m) Conformità al basale del polmone. Confronto tra topi di controllo intatti rispetto a topi con danno polmonare (t-test di Student, P <0,001) e topi con danno polmonare rispetto a topi trapiantati dopo un danno (t-test di Student, P=0,008). (n) Smorzamento del tessuto. Confronto tra topi di controllo e topi con danno polmonare (test t di Student, P=0,015) e topi con danno polmonare rispetto a topi trapiantati dopo un trauma (test t di Student, P=0,021). I valori sono medie ± SEM di 10-15 (n=15 controlli, n=10 feriti e n=10 trattati) topi in ciascun gruppo raccolti da due esperimenti indipendenti topi normali, prevediamo che in pazienti con diverse malattie polmonari, le nicchie polmonari potrebbero essere già parzialmente esaurite e quindi il trapianto potrebbe richiedere un condizionamento meno severo.

Obiettivo Caratterizzare i compartimenti delle cellule staminali nelle loro nicchie in diverse situazioni cliniche (non malate rispetto al tessuto polmonare enfisematoso e fibrotico) e valutare le loro proprietà proliferative e di sviluppo in vitro.

Implementare ulteriormente il sistema di coltura di organoidi polmonari nello screening dei farmaci e nello sviluppo della medicina personalizzata del paziente.

Metodi Le biopsie del tessuto polmonare saranno ottenute mediante procedure chirurgiche: biopsie polmonari aperte. Questa procedura viene eseguita di routine per la diagnosi istologica delle malattie fibrotiche. I pazienti con enfisema e malattia fibrotica allo stadio terminale sono a maggior rischio di sviluppare il cancro ai polmoni. Un'ampia percentuale di pazienti con carcinoma polmonare trattati chirurgicamente presenta enfisema e malattia fibrotica come background istologico. La lobectomia e la pneumonectomia sono frequentemente eseguite come procedure all'avanguardia nella gestione chirurgica del cancro del polmone. Parte del tessuto polmonare resecato contiene cambiamenti enfisematosi e fibrotici o fa sembrare macroscopicamente e microscopicamente normale. Queste aree "non cancerose" saranno campionate e conservate presso la Sheba Tissue Bank per la valutazione insieme a campioni di aree fibrotiche ed enfisematose. Le biopsie saranno analizzate mediante immunoistologia, FACS e organoidi 3D (dopo la rimozione dei fibroblasti) presso il laboratorio di immunologia dell'Istituto Weizmann.

Tutti i campioni saranno raccolti in seguito alle firme del consenso informato dei pazienti sia sul modulo di consenso informato designato per questo protocollo sia sul modulo della banca dei tessuti. Potremmo avere fino a 3-4 pazienti a settimana. I campioni raccolti saranno asportati da personale esperto del Dipartimento di Chirurgia Toracica o del Dipartimento di Patologia (come parte della loro descrizione del lavoro nella Banca dei Tessuti). I campioni freschi saranno trasportati all'istituto Weizmann per FACS e IHC.

Poiché esistono conoscenze molto limitate sui tessuti polmonari umani, sarà obbligatorio testare i tessuti polmonari di polmoni sani e malati. Inizialmente suggeriamo di testare 10-15 tessuti polmonari normali e 15-20 campioni malati durante il periodo di 2 anni. Come accennato in precedenza i tessuti polmonari normali saranno ottenuti come aree "non cancerose" da pazienti sottoposti a lobectomia/pneumonectomia.