Definición del estado de los nichos de células madre pulmonares humanas ex vivo en biopsias tisulares realizadas en pacientes con enfisema y fibrosis intersticial

Antecedentes científicos

Los trastornos pulmonares degenerativos son el resultado de eventos inflamatorios que terminan en la destrucción de la arquitectura pulmonar normal. Existen dos patrones principales:

1. La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una causa importante de morbilidad y mortalidad. Hasta 2020 se prevé que se convierta en la tercera causa de mortalidad tras las enfermedades cardiovasculares y el cáncer. El enfisema es la forma destructiva de la EPOC ya que el tejido alveolado desaparece. Este patrón anatómico no siempre es homogéneo y el deterioro funcional no está relacionado con el grado de destrucción del tejido. La eliminación terapéutica del tejido destruido puede lograrse mediante cirugía o utilizando diversas técnicas de bloqueo (Reducción del Volumen Pulmonar).
2. La fibrosis pulmonar (FP) se caracteriza por una reparación anormal del epitelio respiratorio. Varias enfermedades pueden dar lugar a FP, como infecciones, autoinmunes (trastornos del tejido conectivo), sarcoidosis, neumonitis por hipersensibilidad, neumoconiosis, histiocitosis X, linfangioleiomiomatosis LAM, etc. En muchas situaciones no se puede identificar una relación causa-efecto y la enfermedad es FPI idiopática.

Durante los últimos años, las terapias basadas en células que utilizan células progenitoras y varios andamios estuvieron disponibles en varios campos médicos. La medicina regenerativa pulmonar parece ser una alternativa al trasplante en estas enfermedades terminales.

Sin embargo, la composición celular muy compleja del pulmón, que comprende más de 40 tipos de células diferentes, hace que este objetivo sea un desafío. El revestimiento epitelial del tracto respiratorio, compuesto por partes conductoras y respiratorias, varía a lo largo de su eje proximal-distal. Las vías respiratorias de conducción desde la tráquea hasta los bronquiolos de los pulmones humanos consisten en epitelio pseudoestratificado, que comprende proporciones iguales de células basales, células secretoras y células ciliadas, así como algunas células neuroendocrinas. Los bronquiolos más pequeños, conocidos como bronquiolos terminales y respiratorios, están revestidos por un epitelio cilíndrico o cúbico simple que contiene células secretoras y ciliadas con menos células basales. Los epitelios de estas vías respiratorias de conducción forman una barrera estrecha contra el mundo exterior y están especializados en el proceso de limpieza mucociliar. Los alvéolos están revestidos por células epiteliales alveolares tipo 1 y 2, denominadas AT1 y AT2, respectivamente, en lo sucesivo. Estas células también están especializadas para la función de barrera y las AEC1 extremadamente delgadas comparten una membrana basal con la red circundante de capilares pulmonares para facilitar la difusión de gases entre la atmósfera y la circulación.

Esta distribución general de tipos de células epiteliales se conserva entre humanos y organismos modelo como roedores. Sin embargo, hay diferencias notables. Por ejemplo, la transición de un epitelio pseudoestratificado a cilíndrico ocurre más proximalmente en roedores, por lo que solo la tráquea y los bronquios principales están revestidos con un epitelio pseudoestratificado. Casi todas las vías respiratorias intralobares en ratones están revestidas con un epitelio cilíndrico o cúbico simple con pocas células basales. En ratones, la transición abrupta de una vía aérea de conducción a los alvéolos se conoce como unión de conducto broncoalveolar. En los seres humanos, los bronquiolos terminales dan origen a los bronquiolos respiratorios desde los cuales muchos conductos alveolares terminan finalmente en los alvéolos. Teniendo en cuenta el papel esencial del compartimento epitelial en el pulmón, se ha realizado un gran esfuerzo para identificar las células madre y progenitoras epiteliales responsables de las funciones regenerativas y reparadoras.

Los progenitores epiteliales residen en microambientes o nichos únicos, representados por células vasculares y mesenquimales, que están ricamente inervadas. Esta arquitectura se parece mucho a los nichos de HSM.

Se ha logrado un progreso considerable en ratones hacia la identificación de las señales que regulan la autorrenovación y diferenciación de las células madre epiteliales pulmonares. Estos incluyen Notch, Hippo/Yap, ROS/Nrf2, EGF, FGF, c-myb y citoquinas que incluyen IL-4, -13 y -6. Las células epiteliales vecinas, las células del estroma (incluidas las células mesenquimatosas, los fibroblastos, las células del músculo liso y el endotelio) y las células inmunitarias representan fuentes potenciales de estos factores. Se han definido distintos nichos de células madre en la tráquea y el pulmón de ratones adultos en estado estacionario y cada vez hay más pruebas de que en diferentes condiciones patológicas los nichos de células madre se ven afectados y alterados.

Se sabe muy poco sobre las células madre y los nichos de células madre en el pulmón adulto humano y las señales que regulan el mantenimiento de la homeostasis del tejido pulmonar en la salud y la enfermedad.

Recientemente, el grupo Reisner del Instituto Weizmann ha demostrado que desocupar los nichos de células madre pulmonares es un requisito previo para el trasplante exitoso de progenitores de pulmón humano o de ratón (Nature Medicine 2015). Para ello, utilizaron una lesión pulmonar inicial con naftalina que desencadenó una estimulación inmediata de los progenitores endógenos. Por lo tanto, dentro de las 48 horas, los progenitores en división podrían ser extirpados de manera efectiva mediante irradiación corporal total de 6 Gy, lo que permite el injerto efectivo de los progenitores de pulmón del donante (Fig. 1).

Fig. 1: Injerto y reparación funcional de pulmones lesionados por células pulmonares embrionarias de ratón. Después de la lesión pulmonar con NA y el acondicionamiento con 6Gy TBI, se trasplantaron ratones adultos C57BL/6 con células pulmonares embrionarias singénicas en estadio E16 de donantes GFP+. ( a, b ) Imágenes representativas de enfoque extendido de microscopía de dos fotones de los pulmones de ratones trasplantados 6 semanas después del trasplante, que muestran la profundidad de exploración completa de arriba a abajo del pulmón quimérico, sin (a: z-stack 88 μm) y con (b ) tinción conjunta de vasos sanguíneos con puntos cuánticos (rojo) (barra = 90 μm). (c) Imagen de enfoque extendido de dos fotones, que muestra la profundidad de exploración completa de arriba a abajo del pulmón quimérico (pila z de 96 μm) 16 semanas después del trasplante. ( d ) Microscopía de dos fotones de pulmón de ratón C57BL no trasplantado que muestra el fondo (barra = 90 μm). (e, f, g) Imágenes representativas de pulmones quiméricos teñidos con anti-GFP (verde) y anti-AQP-5 (rojo), lo que indica la incorporación de alveocitos de tipo I derivados de donantes en la superficie de intercambio de gases. (h, i, j) Pulmón quimérico teñido con anticuerpos anti-GFP (verde), anti-Sp-C (azul), que demuestra alveocitos de tipo II que producen surfactante derivado del donante (barras = 20 μm). Todas las imágenes individuales que se muestran arriba son representativas de n = 10 ratones agrupados de 3 experimentos independientes. (m, n) Mediciones de la función pulmonar 6 semanas después del trasplante. ( k, l ) Tinción de pulmón quimérico para CFTR (rojo) y (GFP), que demuestra células donantes positivas para CFTR. (m) Cumplimiento de la línea de base pulmonar. Comparación de ratones intactos de control frente a ratones con lesión pulmonar (prueba t de Student, P <0,001), y de ratones con lesión pulmonar frente a ratones trasplantados después de la lesión (prueba t de Student, P = 0,008). (n) Amortiguación del tejido. Comparación de ratones de control frente a ratones con lesión pulmonar (prueba t de Student, P = 0,015), y de ratones con lesión pulmonar frente a ratones trasplantados después de la lesión (prueba t de Student, P = 0,021). Los valores son medias ± SEM de 10-15 (n=15 control, n=10 lesionados y n=10 tratados) ratones en cada grupo combinados de dos experimentos independientes. ratones normales, prevemos que en pacientes con diferentes enfermedades pulmonares, los nichos pulmonares ya podrían estar parcialmente agotados y, por lo tanto, el trasplante podría requerir un acondicionamiento menos severo.

Objetivo Caracterizar los compartimentos de células madre en sus nichos en diferentes situaciones clínicas (tejido pulmonar no enfermo en comparación con tejido pulmonar enfisematoso y fibrótico) y evaluar sus propiedades proliferativas y de desarrollo in vitro.

Seguir implementando el sistema de cultivo de organoides pulmonares en la detección de fármacos y el desarrollo de medicamentos personalizados para pacientes.

Métodos Las biopsias de tejido pulmonar se obtendrán mediante procedimientos quirúrgicos: biopsias pulmonares abiertas. Este procedimiento se realiza de forma rutinaria para el diagnóstico histológico de enfermedades fibróticas. Los pacientes con enfisema y enfermedad fibrótica en etapa terminal tienen un mayor riesgo de desarrollar cáncer de pulmón. Una gran proporción de pacientes con cáncer de pulmón tratados quirúrgicamente tienen enfisema y enfermedad fibrótica como antecedentes histológicos. La lobectomía y la neumonectomía se realizan con frecuencia como procedimientos de vanguardia en el manejo quirúrgico del cáncer de pulmón. Parte del tejido pulmonar resecado contiene cambios enfisematosos y fibróticos o hace que parezca macroscópica y microscópicamente normal. Estas áreas "no cancerosas" serán muestreadas y preservadas en el Banco de Tejidos de Sheba para su evaluación junto con muestras de áreas fibróticas y enfisematosas. Las biopsias serán analizadas por inmunohistología, FACS y organoides 3D (después de la extracción de fibroblastos) en el laboratorio de inmunología del Instituto Weizmann.

Todas las Muestras se recolectarán siguiendo las firmas de consentimiento informado de los pacientes tanto en el formulario de consentimiento informado designado para este protocolo como en el formulario del banco de tejidos. Podemos tener hasta 3-4 pacientes por semana. Las muestras recolectadas serán resecadas por personal experimentado ya sea del Departamento de Cirugía Torácica o del Departamento de Patología (como parte de su descripción de trabajo en el Banco de Tejidos). Las muestras frescas se transportarán al instituto Weizmann para FACS e IHC.

Dado que existe un conocimiento muy limitado sobre los tejidos pulmonares humanos, será obligatorio analizar los tejidos pulmonares de pulmones sanos y enfermos. Inicialmente sugerimos analizar 10-15 tejidos pulmonares normales y 15-20 muestras enfermas durante el período de 2 años. Como se mencionó antes, los tejidos pulmonares normales se obtendrán como áreas "no cancerosas" de pacientes sometidos a lobectomías/neumonectomías.