Définition du statut des niches de cellules souches pulmonaires humaines ex vivo dans les biopsies tissulaires réalisées chez des patients atteints d'emphysème et de fibrose interstitielle

Contexte scientifique

Les troubles pulmonaires dégénératifs sont le résultat d'événements inflammatoires qui se terminent par la destruction de l'architecture pulmonaire normale. Deux modèles principaux existent :

1. La maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) est une cause majeure de morbidité et de mortalité. D'ici 2020, elle devrait devenir la troisième cause de mortalité après les maladies cardiovasculaires et le cancer. L'emphysème est la forme destructrice de la MPOC car le tissu alvéolé disparaît. Ce schéma anatomique n'est pas toujours homogène et l'atteinte fonctionnelle n'est pas liée à l'importance de la destruction tissulaire. L'élimination thérapeutique des tissus détruits peut être réalisée par chirurgie ou en utilisant diverses techniques de blocage (réduction du volume pulmonaire).
2. La fibrose pulmonaire (PF) est caractérisée par une réparation anormale de l'épithélium respiratoire. Diverses maladies peuvent entraîner une PF telles que les infections, les maladies auto-immunes (troubles du tissu conjonctif), la sarcoïdose, la pneumopathie d'hypersensibilité, la pneumoconiose, l'histiocytose X, la lymphangioléiomyomatose LAM, etc. Dans de nombreuses situations, une relation de cause à effet ne peut être identifiée et la maladie est une FPI idiopathique.

Au cours des dernières années, des thérapies cellulaires utilisant des cellules progénitrices et divers échafaudages sont devenues disponibles dans divers domaines médicaux. La médecine régénérative pulmonaire apparaît comme une alternative à la greffe dans ces maladies en phase terminale.

Cependant, la composition cellulaire très complexe du poumon, comprenant plus de 40 types de cellules différents, rend cet objectif difficile. Le revêtement épithélial des voies respiratoires, composé de parties conductrices et respiratoires, varie le long de son axe proximo-distal. Les voies respiratoires conductrices de la trachée aux bronchioles des poumons humains sont constituées d'épithélium pseudostratifié, comprenant des proportions égales de cellules basales, de cellules sécrétoires et de cellules ciliées, ainsi que de certaines cellules neuroendocrines. Les plus petites bronchioles, appelées bronchioles terminales et respiratoires, sont tapissées d'un simple épithélium cylindrique ou cubique contenant des cellules sécrétoires et ciliées avec moins de cellules basales. Les épithéliums de ces voies respiratoires conductrices forment une barrière étanche contre le monde extérieur et sont spécialisés pour le processus de clairance mucociliaire. Les alvéoles sont tapissées par des cellules épithéliales alvéolaires de type 1 et 2, appelées respectivement AT1 et AT2, ci-après. Ces cellules sont également spécialisées pour la fonction de barrière et les AEC1 extrêmement minces partagent une membrane basale avec le réseau environnant de capillaires pulmonaires pour faciliter la diffusion des gaz entre l'atmosphère et la circulation.

Cette distribution générale des types de cellules épithéliales est conservée entre les humains et les organismes modèles tels que les rongeurs. Cependant, il existe des différences notables. Par exemple, la transition d'un épithélium pseudostratifié à cylindrique se produit plus proximalement chez les rongeurs, de sorte que seules la trachée et les bronches principales sont tapissées d'un épithélium pseudostratifié. Presque toutes les voies respiratoires intralobaires chez la souris sont tapissées d'un simple épithélium cylindrique ou cuboïde avec peu de cellules basales. Chez la souris, la transition abrupte d'une voie aérienne conductrice vers les alvéoles est connue sous le nom de jonction de conduit broncho-alvéolaire. Chez l'homme, les bronchioles terminales donnent naissance à des bronchioles respiratoires à partir desquelles de nombreux canaux alvéolaires se terminent finalement en alvéoles. Compte tenu du rôle essentiel du compartiment épithélial dans le poumon, de nombreux efforts ont été déployés pour identifier les cellules épithéliales souches et progénitrices responsables des fonctions régénératrices et réparatrices.

Les progéniteurs épithéliaux résident dans un microenvironnement ou des niches uniques, représentés par des cellules vasculaires et mésenchymateuses, qui sont richement innervées. Cette architecture ressemble fortement aux niches HSM.

Des progrès considérables ont été réalisés chez la souris vers l'identification des signaux qui régulent l'auto-renouvellement et la différenciation des cellules souches épithéliales pulmonaires. Ceux-ci incluent Notch, Hippo/Yap, ROS/Nrf2, EGF, FGF, c-myb et des cytokines dont IL-4, -13 et -6. Les cellules épithéliales voisines, les cellules stromales (y compris les cellules mésenchymateuses, les fibroblastes, les cellules musculaires lisses et l'endothélium) et les cellules immunitaires représentent toutes des sources potentielles pour ces facteurs. Des niches de cellules souches distinctes ont été définies dans la trachée et les poumons de souris adultes à l'état d'équilibre et il existe de plus en plus de preuves que, dans différentes conditions pathologiques, les niches de cellules souches sont affectées et altérées.

On sait très peu de choses sur les cellules souches et les niches de cellules souches dans le poumon adulte humain et sur les signaux qui régulent le maintien de l'homéostasie du tissu pulmonaire en bonne santé et malade.

Récemment, le groupe Reisner de l'Institut Weizmann a démontré que la libération des niches de cellules souches pulmonaires est une condition préalable à la réussite de la transplantation de progéniteurs pulmonaires de souris ou humains (Nature Medicine 2015). À cette fin, ils ont utilisé une première lésion pulmonaire avec du naphtalène qui a déclenché une stimulation immédiate des progéniteurs endogènes. Ainsi, dans les 48 heures, les progéniteurs en division ont pu être efficacement enlevés par une irradiation corporelle totale de 6 Gy permettant une prise de greffe efficace des progéniteurs pulmonaires du donneur (Fig.1).

Fig. 1 : Prise de greffe et réparation fonctionnelle des poumons lésés par des cellules pulmonaires embryonnaires de souris. Après une lésion pulmonaire avec NA et un conditionnement avec 6Gy TBI, des souris adultes C57BL/6 ont été transplantées avec des cellules pulmonaires embryonnaires syngéniques au stade E16 provenant de donneurs GFP+. ( a, b ) Images représentatives de microscopie à deux photons à mise au point étendue des poumons de souris transplantées 6 semaines après la transplantation, montrant toute la profondeur de balayage de haut en bas du poumon chimérique, sans (a: z-stack 88μm) et avec (b ) co-coloration des vaisseaux sanguins avec des points quantiques (rouge) (barre = 90 μm). (c) Image à mise au point étendue à deux photons, montrant toute la profondeur de balayage de haut en bas du poumon chimérique (z-stack 96μm) 16 semaines après la transplantation. ( d ) Microscopie à deux photons d'un poumon de souris C57BL non transplanté montrant l'arrière-plan (barre = 90 μm). (e, f, g) Images représentatives de poumons chimériques colorés avec anti-GFP (vert) et anti-AQP-5 (rouge), indiquant l'incorporation d'alvéocytes de type I dérivés du donneur dans la surface d'échange de gaz. (h,i,j) Poumon chimérique coloré avec des anticorps anti-GFP (vert), anti-Sp-C (bleu), démontrant un surfactant dérivé du donneur produisant des alvéocytes de type II (barres = 20 μm). Toutes les images individuelles présentées ci-dessus sont représentatives de n = 10 souris regroupées à partir de 3 expériences indépendantes. (m,n) Mesures de la fonction pulmonaire 6 semaines après la transplantation. ( k, l ) Coloration du poumon chimérique pour CFTR (rouge) et (GFP), démontrant des cellules donneuses positives CFTR. (m) Conformité pulmonaire de base. Comparaison des souris témoins intactes avec les souris atteintes de lésions pulmonaires (test t de Student, P < 0,001) et des souris avec lésions pulmonaires avec les souris transplantées après lésion (test t de Student, P = 0,008). (n) Amortissement des tissus. Comparaison des souris témoins par rapport aux souris atteintes de lésions pulmonaires (test t de Student, P = 0, 015) et des souris atteintes de lésions pulmonaires par rapport aux souris transplantées après blessure (test t de Student, P = 0, 021). Les valeurs sont des moyennes ± SEM de 10-15 (n = 15 témoins, n = 10 blessés et n = 10 traités) souris dans chaque groupe regroupées à partir de deux expériences indépendantes Cependant, alors que ce conditionnement était nécessaire pour permettre une prise de greffe efficace des progéniteurs pulmonaires du donneur dans souris normales, nous envisageons que chez les patients atteints de différentes maladies pulmonaires, les niches pulmonaires pourraient déjà être partiellement épuisées et, par conséquent, la transplantation pourrait nécessiter un conditionnement moins sévère.

Objectif Caractériser les compartiments des cellules souches dans leurs niches dans différentes situations cliniques (non malades par rapport aux tissus pulmonaires emphysémateux et fibrotiques) et évaluer leurs propriétés prolifératives et développementales in vitro.

Mettre en œuvre davantage le système de culture d'organoïdes pulmonaires dans le dépistage des médicaments et le développement de la médecine personnalisée des patients.

Méthodes Des biopsies de tissu pulmonaire seront obtenues par des procédures chirurgicales : biopsies pulmonaires ouvertes. Cette procédure est couramment réalisée pour le diagnostic histologique des maladies fibrotiques. Les patients atteints d'emphysème et d'une maladie fibrotique en phase terminale sont plus à risque de développer un cancer du poumon. Une grande proportion de patients atteints d'un cancer du poumon traités chirurgicalement ont un emphysème et une maladie fibrotique comme arrière-plan histologique. La lobectomie et la pneumonectomie sont fréquemment pratiquées comme des procédures de pointe dans la prise en charge chirurgicale du cancer du poumon. Une partie du tissu pulmonaire réséqué contient des modifications emphysémateuses et fibrotiques ou donne un aspect macroscopiquement et microscopiquement normal. Ces zones "non cancéreuses" seront échantillonnées et conservées à la Sheba Tissue Bank pour évaluation avec des échantillons provenant de zones fibrotiques et emphysémateuses. Les biopsies seront analysées par immunohistologie, FACS et organoïdes 3D (après prélèvement des fibroblastes) au laboratoire d'immunologie de l'Institut Weizmann.

Tous les échantillons seront prélevés après les signatures de consentement éclairé des patients à la fois sur le formulaire de consentement éclairé désigné pour ce protocole et sur le formulaire de la banque de tissus. Nous pouvons avoir jusqu'à 3-4 patients/semaine. Les échantillons prélevés seront réséqués par du personnel expérimenté du service de chirurgie thoracique ou du service de pathologie (dans le cadre de leur description de poste à la banque de tissus). Des échantillons frais seront transportés à l'institut Weizmann pour FACS et IHC.

Comme les connaissances sur les tissus pulmonaires humains sont très limitées, il sera obligatoire de tester les tissus pulmonaires des poumons sains et malades. Au départ, nous suggérons de tester 10 à 15 tissus pulmonaires normaux et 15 à 20 échantillons malades pendant une période de 2 ans. Comme mentionné précédemment, les tissus pulmonaires normaux seront obtenus en tant que zones "non cancéreuses" de patients subissant des lobectomies/pneumonectomies.